去甲斑蝥素对雄激素非依赖型前列腺癌PC-3细胞增殖、凋亡的影响*

雒向宁,王文娟,李 凯,杜宏宏

1.陕西中医药大学附属医院泌尿外科(咸阳712000);2.陕西中医药大学生物实验中心(咸阳712000)

前列腺癌是最常见的男性生殖系统恶性肿瘤，多见于60岁以上的老年男性。据统计，美国男性人群中大约有15%会发生前列腺癌[1]。近10年以来，我国的前列腺癌发病率也呈逐年上升趋势。前列腺癌包括雄激素依赖型(Androgen dependent prostate cancer，ADPC)和雄激素非依赖型(Androgen independent prostate cancer，AIPC)。绝大多数前列腺癌患者起初为ADPC，即对抑制雄激素的内分泌药物治疗敏感有效。然而，经抑制雄激素的内分泌治疗平均2.5年后，上述患者均将转化为AIPC，即对抑制雄激素的内分泌治疗无反应。后者病情进展迅速，生存期一般不超过18个月。因此，AIPC的替代治疗药物研发成为研究热点。去甲斑蝥素是从动物类药物斑蝥虫体内提取斑蝥素的去甲基化类似物。现有研究显示，去甲斑蝥素具有强大的抗癌活性，目前已应用于多种恶性肿瘤的临床治疗。本次实验重在研究去甲斑蝥素是否具有抑制AIPC细胞PC-3增殖及诱导其凋亡的作用。

材料与方法

1 实验材料 PC-3细胞株购自上海细胞所国家细胞库；去甲斑蝥素购自Aladdin公司，CCK-8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自Beyotime公司，细胞周期检测试剂盒购自南京凯基生物公司，荧光倒置显微镜(日本，OLYMPUS)，CO2恒温培养箱(日本，SANYO)，酶标仪(美国，Thermo)。

2 实验方法 ①细胞培养：将解冻复苏后的PC-3细胞接种在含有 10% 胎牛血清的完全培养液中，在37 ℃ 5% CO2培养箱内，饱和湿度条件下培养。②细胞生长抑制实验：参照CCK-8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒步骤说明，取处于对数生长期，生长状态良好的PC-3细胞，用1640培养基调整细胞密度到5×103个/100 μl，接入96孔板，每孔100 μl细胞悬液，同时设空白对照组，37 ℃培养过夜，加入100 μl不同浓度培养液配制的去甲斑蝥素，使最终浓度为12.5、25.0、50.0 μg/ml，每组3个复孔，37 ℃培养48 h。培养结束以后，每孔加入10 μl CCK-8，37 ℃培养4 h，用酶标仪检测450 nm处吸光度值。③细胞周期和凋亡率测定：按照细胞周期检测试剂盒说明，取对数生长期的PC-3细胞，加入不同浓度的含去甲斑蝥素培养液，使去甲斑蝥素最终浓度分别为12.5、25.0、50.0 μg/ml，同时设立空白对照组，37 ℃分别培养48 h。流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率，倒置显微镜下观察细胞形态。

结 果

1 去甲斑蝥素对PC-3细胞生长的影响 空白对照组、12.5、25.0、50.0 μg/ml的去甲斑蝥素作用于PC-3细胞，作用48 h后，PC-3细胞受到不同程度地抑制，并呈剂量-效应关系。去甲斑蝥素浓度为12.5、25.0、50.0 μg/ml时的抑制率分别为(22.16±4.26)%、(46.71±0.98)%、(52.54 ±3.48)%，随着去甲斑蝥素药物浓度的增加，对PC-3细胞的生长抑制效果越加增强，呈现明显的量-效关系，与空白对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。IC50为45.87 μg/ml。

2 去甲斑蝥素对PC-3细胞周期的影响 去甲斑蝥素作用PC-3细胞48 h后，可使PC-3细胞的G0/G1期细胞显著减少，S、G2期PC-3细胞增加，且作用随着去甲斑蝥素的浓度增加呈现剂量-效应关系，见表1、图1。

A：空白对照组；B：12.5 μg/ml 去甲斑蝥素组；C：25.0 μg/ml 去甲斑蝥素组；D：50.0 μg/ml 去甲斑蝥素组

表1 不同浓度去甲斑蝥素对PC-3细胞周期的影响

3 去甲斑蝥素对PC-3凋亡率的影响 流式细胞法测定三种去甲斑蝥素浓度剂量作用于PC-3细胞48 h后的凋亡率，与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，且作用随着去甲斑蝥素的浓度增加呈现剂量-效应关系，见表2。

表2 不同浓度去甲斑蝥素对PC-3细胞凋亡率的影响

4 倒置显微镜观察细胞形态 空白对照组、12.5、25.0、50.0 μg/ml去甲斑蝥素组分别作用于PC-3细胞48 h后：空白对照组PC-3细胞活跃生长，呈上皮样贴壁繁殖，细胞之间紧密连接。各浓度去甲斑蝥素组PC-3细胞体积均变小、变圆，细胞膜完整，细胞间连接疏松，贴壁能力明显减弱，吹打易离壁漂浮，生长明显受抑制。且生长抑制率与去甲斑蝥素浓度正相关。见图2。

讨 论

绝大多数前列腺癌患者类型起初为雄激素依赖型，即对抑制雄激素的内分泌药物治疗敏感有效，因此，雄激素剥脱治疗(Androgen deprivation therapy，ADT) 是目前针对ADPC患者重要的治疗方法。但经过平均2.5年的治疗后，上述类型的患者将进展为雄激素非依赖型，即经过ADT治疗，由于前列腺癌细胞的雄激素受体改变等原因，导致患者对ADT治疗失效，进入AIPC阶段，出现疾病进展[2]。针对ADT治疗失效的前列腺癌患者病理机制的基础研究显示，AIPC患者体内的前列腺癌组织中，仍存在持续分泌雄激素的能力，雄激素高水平的持续表达，可以继续活化雄激素受体，刺激患者机体前列腺癌细胞不断增殖，使得前列腺癌病情恶化蔓延[3-4]。由此可见，阻断雄激素合成或转化，仍然是治疗ADT失效的前列腺癌的关键机制。近年研究发现的CYP17，是一种阻滞机体合成雄激素的关键限速酶，已经证实，CYP17广泛存在于机体的部分内分泌器官(如肾上腺、前列腺和睾丸组织)。而醋酸阿比特龙能够特异性抑制CYP17的活性，能够抑制来源于上述内分泌器官、尤其是前列腺癌细胞的雄激素合成[5]，属于新一代的雄激素抑制药物，能够有效抑制雄激素在上述组织、特别是前列腺癌组织的生物合成。最新研究结果显示，醋酸阿比特龙可以特异性地结合CYP17酶，且亲和度较高，能够有效地减少相关内分泌组织器官的雄激素分泌。减少自然合成来源的雄激素和前列腺癌组织内的雄激素水平，最终达到遏制ADT治疗失效的AIPC的疾病进展。然而，基于上述醋酸阿比特龙的特殊药理机制，患者在服用该药物后，将不同程度地引起患者促肾上腺皮质激素含量的升高，从而容易发生高血压、低钾血症和水钠潴留等副作用，严重者甚至出现严重的肝肾毒性损害[6]。同时，醋酸阿比特龙价格较为昂贵，对患者带来较大的经济负担，上述各种因素的存在，限制了阿比特龙的临床应用。

去甲斑蝥素是一种由我国最先成功提取合成的新型抗肿瘤药物，是由动物类中药斑蝥虫体内提纯的斑蝥素的衍生物(斑蝥素去除1，2位两个甲基)，能够发挥强大的抗癌作用[7]，并且同时具有升高患者外周血白细胞的作用。本实验首先采用CCK-8法观察了去甲斑蝥素对人前列腺癌PC-3细胞生长增殖的影响。实验结果表明，与空白对照组相比，浓度为12.5、25.0、50.0 μg/ml的去甲斑蝥素作用PC-3细胞48 h，均可显著抑制人前列腺癌细胞PC-3的细胞生长，且呈浓度依赖性。其IC50值为45.87 μg/ml，说明去甲斑蝥素可浓度依赖地抑制前列腺癌PC-3细胞的生长增殖。流式细胞术检测发现，去甲斑蝥素可使前列腺癌PC-3细胞的G0/G1期细胞显著减少，S、G2期PC-3细胞增加，且作用随着去甲斑蝥素的浓度增加呈现剂量-效应关系。流式细胞术检测12.5、25.0、50.0 μg/ml浓度的去甲斑蝥素作用PC-3细胞48 h凋亡率，提示去甲斑蝥素可以明显增加PC-3细胞的凋亡率，且与去甲斑蝥素的作用浓度正相关。通过倒置显微镜观察不同浓度去甲斑蝥素作用48 h后的PC-3细胞，细胞体积均变小，细胞间连接疏松，贴壁能力明显减弱，易离壁漂浮，生长明显受抑制，且生长抑制程度与去甲斑蝥素的干预浓度正相关。上述实验结果表明去甲斑蝥素能够抑制PC-3细胞生长，可能的机制是去甲斑蝥素诱导PC-3细胞发生凋亡并阻滞PC-3细胞的有丝分裂。

根据现有研究，去甲斑蝥素抗肿瘤作用机制主要包括以下5个方面。①抑制肿瘤细胞增殖：恶性细胞以有丝分裂方式“无限增殖”是产生人体恶性肿瘤细胞的直接原因。多项实验发现，去甲斑蝥素对人体多种恶性肿瘤细胞的增殖呈现出抑制效果。有国内学者[8]研究去甲斑蝥素对体外培养乳腺癌MCF-7细胞的抑制作用，结果表明，去甲斑蝥素能有效抑制MCF-7细胞体外增殖速度，且高浓度、长时间的去甲斑蝥素抑制效果更明显，存在去甲斑蝥素作用浓度与时间的依赖性。另有学者观察到去甲斑蝥素对体外培养肺癌细胞A549呈现显著的抑制作用，进一步研究发现[9]，肺癌A549细胞在去甲斑蝥素作用下，大量细胞阻滞于G2/M期，同时癌细胞内的ER-K1/2基因表达明显降低。②促进肿瘤细胞凋亡：正常的人体细胞，增殖和凋亡是一对同时存在的生命现象，两者长期处于此消彼长的稳定状态，而恶性肿瘤细胞的增殖和凋亡则打破了两者的稳定关系，进入“失衡状态”。人体恶性肿瘤细胞发生的重要原因之一，正是由于凋亡过程在细胞内受到某些因素抑制，使细胞不能进入“程序性死亡”，出现恶性无限增殖现象。有学者[10]采用不同浓度的去甲斑蝥素作用于人肝癌SMMC-7721细胞后，检测凋亡相关因子的表达，结果发现，去甲斑蝥素可促进Caspase-3、Bax和细胞色素C的表达，发挥诱导SMMC-7721细胞凋亡的作用，并且上述三种凋亡相关因子的表达量与去甲斑蝥素的作用浓度正相关。实验研究显示[11]，不同浓度的去甲斑蝥素处理人胃癌SGC-7901细胞后，抗凋亡蛋白因子表达减少，促凋亡蛋白因子表达则显著增加，不同浓度去甲斑蝥素均对SGC-7901细胞产生促凋亡作用，使得SGC-7901细胞结构破坏，生长周期停滞在G2/M期，且其促凋亡作用与药物作用时间及药物浓度呈相关性，说明去甲斑蝥素是通过调控肿瘤细胞各种抗凋亡因子与促凋亡因子的表达来发挥诱导肿瘤细胞凋亡作用。③抑制肿瘤细胞DNA复制：DNA复制起始蛋白是所有真核细胞启动DNA复制必须的调控因子，包括Cdc-6、Orc、Cdt1和Mcm2-7，其中Cdc-6蛋白属于癌基因蛋白，可促发良性细胞向恶性转变。通过抑制Cdc-6的表达，可以产生抗癌作用。实验研究显示[12]，在去甲斑蝥素的药物作用下，人宫颈癌HeLa细胞、人肝癌HepG2细胞、T淋巴瘤Jurkat细胞以及人B淋巴细胞瘤Ramos细胞的DNA复制起始蛋白Cdc-6均被明显降解，上述各种恶性细胞的体外生长均受到抑制，并呈现去甲斑蝥素药物剂量依赖性。说明去甲斑蝥素能够直接干扰细胞DNA的遗传复制，实现抑制肿瘤细胞复发和扩散的目的。④干扰肿瘤细胞的细胞周期：有丝分裂也是肿瘤细胞的生长方式。有研究显示[13]，去甲斑蝥素作用于人卵巢癌SK-OV-3细胞时，可以将癌细胞大量阻滞于有丝分裂的G2/M期，使有丝分裂停滞不前。有学者[14]采用去甲斑蝥素作用于白血病K562细胞株，发现去甲斑蝥素可将K562 细胞大量地阻滞于G0/ G1期，抑制有丝分裂进程，同时具有明显的细胞毒作用。⑤抑制肿瘤细胞的侵袭转移：恶性肿瘤细胞有别于正常细胞和良性肿瘤细胞的主要原因是，前者能够从原发部位经过血液和淋巴途径，转移到远处的正常组织和器官，造成转移播散进展。内皮血管生长因子过度表达是刺激肿瘤滋养血管生成的重要因子，基质金属蛋白酶-2是重要的蛋白水解酶，与癌细胞突破外周组织基底膜向远处侵袭转移密切相关，已有研究证实[15]，在去甲斑蝥素作用于人膀胱癌T24细胞后，可以下调基质金属蛋白酶-2和内皮血管生长因子的表达，降低膀胱癌的侵袭与转移能力。还有学者[16]实验证实，去甲斑蝥素能够显著抑制体外培养的皮肤鳞状细胞癌A431细胞的体外黏附、侵袭和迁移能力，其机制可能与其能下调内皮血管生长因子和基质金属蛋白酶-2蛋白表达水平相关。本次实验发现去甲斑蝥素能够诱导人雄激素非依赖型前列腺癌PC-3细胞的凋亡并干扰PC-3细胞的有丝分裂，进而对PC-3细胞增殖产生抑制作用，提示去甲斑蝥素或可成为治疗AIPC的有效辅助药物。去甲斑蝥素影响PC-3细胞周期并诱导其凋亡的详细病理机制，还有待进一步实验研究。