电针预处理对兔脊髓缺血再灌注损伤后炎性因子的影响

姚梦莉，陈向华，陈朝晖*，王 海

1 安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥230038；2 安徽中医药大学针灸推拿学院，安徽 合肥230038；3 徐州市中医院，江苏 徐州221000

* 通信作者：陈朝晖，E-mail：czhn007@163.com

脊髓缺血再灌注损伤（spinal cord ischemic reperfusion injury，SCII）是脊髓组织经历一段时间缺血再次恢复血供后，脊髓组织功能结构损伤加重，甚至脊髓神经元发生不可逆性损伤［1］。 它是一种严重的继发性损伤，是临床上造成主动脉瘤、脊柱骨折、骶管肿瘤等手术术后截瘫的最主要原因，其发生率可达10%～40%，对患者的身心健康造成严重危害。SCII 与脊髓组织的原发性损伤不同，其属于二次损伤，具有可预见性，因此早预防、早治疗十分必要。已有研究证实，炎症反应是影响SCII 病理进程的重要因素［2］，因此抑制炎症反应是治疗SCII 的可行策略之一。 目前电针广泛应用于脊髓损伤的临床治疗，疗效显著，对于其在SCII 的应用多集中于基础研究［2-3］。有研究表明，电针具有减轻炎症反应、缓解疼痛，改善脊髓水肿、保护神经元等功效［4］。功能性磁共振成像（functional magnetic resonance imaging，fMRI）和弥散张量纤维束成像（diffusion tensor imaging，DTI）则显示［5-6］，电针可激活脊柱功能区，调整脊柱纤维束形态，恢复脊柱功能结构。 本研究通过电针预处理SCII 模型兔，观察不同时点白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等致炎因子和白细胞介素-1 受体拮抗剂（IL-1Rα）抗炎因子的变化，进一步明确电针预处理SCII 的免疫机制，为临床治疗SCII 提供依据。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物

安徽中医药大学实验动物中心提供成年健康SPF 级新西兰大白兔24 只，雌雄各半，单笼饲养，自由饮水摄食，体质量2.0～2.5 kg。 实验遵循《实验动物管理与使用指南》［7］，并通过安徽中医药大学医学伦理委员会批准（批号：AHUCM-rabbits-2019010）。

1.2 主要实验试剂与设备

乌拉坦（武汉久安药业有限公司）；30%过氧化氢（武汉久安药业有限公司）；DAB 染色剂和IL-1β+bs-0812R（均购自上海苏懿化学试剂有限公司）；兔IL-1β 试剂盒、兔IL-6 试剂盒、兔TNF-α 试剂盒、兔IL-1Rα 试剂盒（均购自上海三发科学仪器有限公司）；光学显微镜（日本奥林巴斯公司，Nikon牌）；毫针（合肥有为康设备有限公司，华佗牌1.5 寸）；酶标仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司，RT-6000）；电针仪（合肥有为康设备有限公司，SDZ-II型）。

1.3 分组及模型制备

1.3.1 实验分组 将24 只新西兰大白兔按照随机数字表法分为模型组、假手术组、电针组，每组8 只。

1.3.2 模型制备 采用Zivin 法［8］进行造模。 术前禁食12 h。 20%的乌拉坦（6 mL／kg）耳缘静脉注射麻醉，兔仰卧位固定，手术范围内备皮，常规消毒，气管插管，保持呼吸道。 距兔剑突下约1 寸处行腹部正中切口，切口长度约3～4 cm，清洁纱布包裹大网膜和胃肠管，推开并暴露腹主动脉，钝性分离约0.5 cm，以肾上腺为标志，靠近右肾动脉的近心端起始部夹闭腹主动脉，当触及腹主动脉远端波动感消失开始计时，用血管钳把切口进行临时夹闭，30 min后取出动脉夹，确定腹主动脉远端搏动恢复后，无菌纱布清除腹腔渗出液，复位胃肠等器官，逐层缝合，关闭腹腔。 假手术组不夹闭腹主动脉，其余步骤相同。 保持室内温度22 ℃，注意动物保暖直至清醒，术后予以青霉素抗感染治疗4 d，正常饮水摄食。

1.4 实验动物处理

1.4.1 模型组 造模成功后，连续4 d 给予青霉素20 万U／d 肌肉注射，饲料喂养，正常饮水、自由活动。

1.4.2 假手术组 模型制备及实验动物处理同模型组，但不夹闭腹主动脉。

1.4.3 电针组 兔脊髓缺血再灌注模型诱导前30 min进行电针干预治疗，采用SDZ-II 型电针仪，参照《实验针灸学》［9］的操作方法，针刺双侧“悬钟”和“阳陵泉”2 个穴位。电针参数：疏密波，10 Hz，电针强度要让肢体保持轻微颤动，治疗时间为30 min［10］。

1.5 观察指标及方法

1.5.1 IL-1β、IL-6、TNF-α 和IL-1Rα 检测 分别于造模前0 h 及缺血再灌注后4、8、12 h 这4 个时间点采集兔股静脉血2 mL 于试管中，静置30 min后以3 000 r／min 的速度将血液离心20 min，然后移液器取上清液，置于-20 ℃冰箱中保存待测。采用ELISA 法检测血清 中IL-1β、IL-6、TNF-α 和IL-1Rα 的表达，检测严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作。

1.5.2 脊髓组织变化观察 取血完成后采用耳缘静脉空气栓塞法处死兔，确定L2～5的位置，使用咬骨钳咬断棘突和椎板，手术刀清理脊柱周围软组织，手术剪剪断附着的脊神经根，取出L2～5段的脊髓组织后，用生理盐水冲洗干净，固定于10%的福尔马林溶液中，再经过脱钙、脱水、透明、石蜡包埋等步骤将标本制作成蜡块，切片，厚度约为5 mm，行苏木精-伊红染色（HE 染色），光学显微镜下观察脊髓组织变化并采集照片。

1.5.3 IL-1β、IL-6、TNF-α 定位及表达检测 取上述蜡块，切片、脱蜡，3% H2O2水孵育5 min，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）冲洗干净，滴加一抗后PBS 冲洗，接着滴加二抗室温孵育10 min，PBS 再次冲洗，然后使用DAB 溶液让脊髓组织显色，经过冲洗、复染、脱水、封片步骤，最后在光学显微镜下观察并采集照片。 兔脊髓组织中IL-1β 的表达以间质及胞浆被染成棕褐色为阳性表达，IL-6、TNF-α 的阳性表达则为神经元胞浆及突起中被染成棕褐色。

1.6 统计学方法

利用SPSS 23.0 统计软件进行统计分析。 计量资料服从正态分布采用（±s）表示，各组兔血清中多时点炎症因子含量符合正态分布，采用重复测量方差分析，两两比较采用LSD-t法；各组兔脊髓组织中蛋白平均灰度值满足独立、正态、方差齐性，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 3 组兔脊髓组织形态学变化

研究结果显示，假手术组兔脊髓组织中神经元轮廓清晰，胞体较大且圆润，胞浆染色均匀，胞核及核仁完整清楚，树突、轴突完整存在，整个组织的结构较为清楚、完整。 模型组兔脊髓组织中神经元数目减少，细胞胞核及胞浆染色变浅，胞核固缩或消失，核膜的边界不清晰，或者核破碎、或者核溶解甚至出现核仁消失，轴突出现扩大或肿胀或消失等病理改变，神经细胞的周围存有透亮区，甚至坏死后留下空腔。 与模型组比较，电针组神经元的数目增加，变形、坏死减少，其结构也更为清晰，细胞胞核及胞浆染色变深，胞核及核仁轻度肿胀，萎缩减轻，神经元的存活密度增加，整体破坏程度减轻。 见图1。

图1 3 组兔脊髓组织病理显微结构（HE 染色×400）Figure 1 Pathological microstructure of spinal cord tissue in three groups of rabbits （HE staining×400）

2.2 3 组兔炎症因子表达变化

2.2.1 3 组IL-1β 含量比较 见表1。

2.2.2 3 组IL-6 含量比较 见表2。

2.2.3 3 组TNF-α 含量比较 见表3。

表1 3 组兔脊髓缺血再灌注损伤IL-1β 水平比较（±s） 匹克／毫升Table 1 Comparison of IL-1β level in spinal cord ischemia-reperfusion injury of rabbits in three groups （±s）pg／mL

表1 3 组兔脊髓缺血再灌注损伤IL-1β 水平比较（±s） 匹克／毫升Table 1 Comparison of IL-1β level in spinal cord ischemia-reperfusion injury of rabbits in three groups （±s）pg／mL

注：与模型组缺血前比较，1） P＜0.05；与假手术组同一时间点比较，2） P＜0.05；与模型组同一时间点比较，3） P＜0.05。Note: Compared with the model group before ischemia, 1) P＜0.05; Compared with the sham operation group at the same time,2) P＜0.05; Compared with the model group at the same time, 3) P＜0.05.

组别假手术组模型组电针组n 8 8 8缺血前24.38±1.49 24.42±2.20 24.16±1.59再灌注后4 h 23.86±1.09 42.90±1.971）2）28.36±1.002）3）8 h 25.10±1.05 66.24±1.761）2）37.97±1.352）3）12 h 24.83±1.38 67.53±2.071）2）41.03±1.592）3）

2.2.4 3 组IL-1Rα 含量比较 见表4。

2.3 3 组兔促炎因子定位及表达变化

假手术组无特殊阳性表达，着色均匀。 模型组胞核着色不均或不着色，IL-1β 大量表达在细胞间质及胞浆中，IL-6 和TNF-α 则大量表达在神经元胞浆及突起中。 电针组间质及胞浆中IL-1β、IL-6、TNF-α 的表达明显减少，见图2、图3、图4。 与假手术组同一时间点比较，模型组与电针组IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量表达均明显上升，模型组含量最高，电针组次之；与模型组同一时间点比较，电针组IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量表达明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。 见表5。

表2 3 组兔脊髓缺血再灌注损伤IL-6 水平比较（±s） 匹克／毫升Table 2 Comparison of IL-6 level in spinal cord ischemia-reperfusion injury of rabbits in three groups （±s）pg／mL

表2 3 组兔脊髓缺血再灌注损伤IL-6 水平比较（±s） 匹克／毫升Table 2 Comparison of IL-6 level in spinal cord ischemia-reperfusion injury of rabbits in three groups （±s）pg／mL

注：与模型组缺血前比较，1） P＜0.05；与假手术组同一时间点比较，2） P＜0.05；与模型组同一时间点比较，3） P＜0.05。Note: Compared with the model group before ischemia, 1) P＜0.05; Compared with the sham operation group at the same time,2) P＜0.05; Compared with the model group at the same time, 3) P＜0.05.

组别假手术组模型组电针组n 8 8 8缺血前123.51±4.66 119.47±5.63 120.85±3.70再灌注后4 h 121.92±2.67 174.24±6.021）2）193.74±2.522）3）8 h 125.97±3.74 205.40±4.251）2）231.91±3.272）3）12 h 127.78±1.82 252.77±3.421）2）227.24±2.252）3）

表3 3 组兔脊髓缺血再灌注损伤TNF-α 水平比较（±s） 匹克／毫升Table 3 Comparison of TNF-α level in spinal cord ischemia-reperfusion injury of rabbits in three groups （±s）pg／mL

表3 3 组兔脊髓缺血再灌注损伤TNF-α 水平比较（±s） 匹克／毫升Table 3 Comparison of TNF-α level in spinal cord ischemia-reperfusion injury of rabbits in three groups （±s）pg／mL

注：与模型组缺血前比较，1） P＜0.05；与假手术组同一时间点比较，2） P＜0.05；与模型组同一时间点比较，3） P＜0.05。Note: Compared with the model group before ischemia, 1) P＜0.05; Compared with the sham operation group at the same time,2) P＜0.05; Compared with the model group at the same time, 3) P＜0.05.

组别假手术组模型组电针组n 8 8 8缺血前173.28±3.40 170.90±6.67 172.24±5.04再灌注后4 h 176.31±4.37 438.14±5.121）2）376.95±4.572）3）8 h 174.43±3.92 479.51±4.281）2）416.88±2.832）3）12 h 176.54±4.93 447.66±8.501）2）380.78±8.862）3）

表4 3 组兔脊髓缺血再灌注损伤IL-1Rα 水平比较（±s） 匹克／毫升Table 4 Comparison of IL-1Rα level in spinal cord ischemia-reperfusion injury of rabbits in three groups （±s）pg／mL

表4 3 组兔脊髓缺血再灌注损伤IL-1Rα 水平比较（±s） 匹克／毫升Table 4 Comparison of IL-1Rα level in spinal cord ischemia-reperfusion injury of rabbits in three groups （±s）pg／mL

注：与模型组缺血前比较，1） P＜0.05；与假手术组同一时间点比较，2） P＜0.05；与模型组同一时间点比较，3） P＜0.05。Note: Compared with the model group before ischemia, 1) P＜0.05; Compared with the sham operation group at the same time,2) P＜0.05; Compared with the model group at the same time, 3) P＜0.05.

组别假手术组模型组电针组n 8 8 8缺血前97.20±2.68 98.00±3.19 97.37±4.96再灌注后4 h 99.47±3.15 131.07±2.981）2）148.46±8.152）3）8 h 98.86±2.96 136.24±4.311）2）133.75±7.832）12 h 96.15±2.17 101.13±2.87 108.05±3.222）

图2 3 组兔脊髓组织IL-1β 阳性表达（×200）Figure 2 Positive expression of IL-1β in spinal cord tissue of rabbits in three groups (×200)

图3 3 组兔脊髓组织IL-6 阳性表达（×200）Figure 3 Positive expression of IL-6 in spinal cord tissue of rabbits in three groups (×200)

图4 3 组兔脊髓组织TNF-α 阳性表达（×200）Figure 4 Positive expression of TNF-α in spinal cord tissue of rabbits in three groups (×200)

表5 3 组兔脊髓IL-1β、IL-6、TNF-α 阳性AOD 值比较（±s）Table 5 Comparison of positive AOD values of IL-1β，IL-6 and TNF-α in spinal cord of rabbits in three groups （±s）

表5 3 组兔脊髓IL-1β、IL-6、TNF-α 阳性AOD 值比较（±s）Table 5 Comparison of positive AOD values of IL-1β，IL-6 and TNF-α in spinal cord of rabbits in three groups （±s）

注：与假手术组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05。Note: Compared with the sham operation group, 1) P＜0.05; Compared with the model group, 2) P＜0.05.

TNF-α 0.23±0.002 2 0.49±0.001 31）0.33±0.002 41）2）组别假手术组模型组电针组n 5 5 5 IL-1β 0.36±0.002 8 0.48±0.002 81）0.39±0.002 61）2）IL-6 0.35±0.003 0 0.44±0.004 11）0.39±0.002 91）2）

3 讨 论

炎症因子分为促炎因子和抑炎因子两部分，在发生损伤的早期阶段，机体会分泌适量的促炎因子建立防御机制，抵御伤害。 在各种因素的影响下，机体自身的调节功能失衡，会产生过量的促炎因子，引起瀑布样炎症反应，导致炎症反应失控，引发全身炎症反应综合征，甚至多器官功能障碍综合征等严重后果，造成器官和躯体损害。 SCII 就是脊髓炎症反应失控的一种表现，在脊髓缺血再灌注过程中，免疫炎症反应倾向于造成脊髓损伤。

3.1 脊髓缺血再灌注损伤后TNF-α、IL-6、IL-1β及IL-1Rα 等炎症因子表达明显上升

ELISA 法检测结果显示，与假手术组比较，模型组促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β 与抑炎因子IL-1Rα 在再灌注4、8、12 h 均有不同程度的上升；此外，免疫组化分析结果显示模型组促炎因子表达也明显上升，其表达位置集中在神经元胞浆中。 这提示促炎因子与抑炎因子均参与了脊髓炎症反应。 炎症反应发生可能会造成脊髓组织损伤， 本研究的HE 染色结果证实了这一观点。 模型组兔脊髓组织光镜下显示脊髓组织中神经元数量减少，细胞胞核及胞浆着色较浅，胞核固缩或消失等病理变化。 IL-1Rα 是一种天然抗炎剂，其与IL-1β 受体结合切断IL-1β 生物活性，具有很好的抗炎作用。IL-1Rα 水平在再灌注后4 h 有明显表达，再灌注后8 h 时达到高峰，再灌注后12 h 时呈下降趋势；而IL-1β 在再灌注后4、8、12 h 均上升，但在再灌注后12 h 时上升幅度减小，证实IL-1Rα 对IL-1β 具有明显抑制作用，这提示IL-1Rα 只在再灌注后8 h 内发挥最大的保护作用，因此其抗炎作用有限。

TNF-α 作为机体内多种细胞因子的启动因子，具有协同放大炎症级联反应的作用［11］。 本研究结果显示，模型组TNF-α 的表达在再灌注后8 h 达最高峰，这与苏权等［12］研究结果一致。 而安民等［13］实验研究结果则显示，脊髓组织中的TNF-α 在再灌注后6、12、24 h 均保持高水平的表达，在再灌注后12 h 时达最高峰，这种差异可能与检测材料、观察时间点不同有关。 这提示，TNF-α 在不同时间点脊髓炎症反应中均具有重要的意义。在再灌注后4、8、12 h 3 个时间点TNF-α 的变化规律与IL-1Rα 一致，但这种变化规律究竟是由于IL-1Rα 的影响，还是TNF-α 本身的变化规律尚不明确，需要后续进一步研究。

IL-6 是具有促炎作用的细胞因子，在SCII 早期即有明显表达，可以进一步加剧炎症反应，损伤脊髓［14］。 本研究结果显示，IL-6 在再灌注后4、8、12 h 3 个时间点的表达均呈现上升趋势，这与TNF-α的变化趋势不同。 这提示，IL-6 在脊髓炎症反应中可能发挥更重要的作用。 因此，平衡炎症因子表达，抑制炎症反应是减轻脊髓缺血再灌注损伤的主要策略。

3.2 电针预处理干预有助于抑制脊髓缺血再灌注损伤后炎症反应

本研究结果显示，与模型组同一时间比较，电针组IL-1β、IL-6、TNF-α 的表达均明显改变，再灌注损伤后4、8、12 h 电针组IL-1β、TNF-α 表达均明显降低，而IL-6 在再灌注损伤后4、8 h 表达明显上升，12 h 表达明显下降，这提示电针可有效抑制IL-1β、TNF-α 的表达，具有良好的抑炎作用，但对IL-6 的抑制作用不明显；与模型组再灌注4 h 比较，电针组IL-1Rα 的表达上升，之后呈逐渐降低趋势，这与IL-1β、TNF-α 的表达趋势相反，这提示电针促进IL-1Rα 的表达具有时间窗效应。 因此，临床上可以通过电针疗法抑制炎症反应，有效减轻脊髓损伤后的继发性损害，保护脊髓组织，但在治疗时应注意时间窗效应。

HE 染色结果显示，与模型组比较，电针组脊髓组织出现神经元数量增加，细胞胞核、核仁萎缩减轻，细胞破坏程度下降等良好变化，这与唐能能等［15］的研究结果一致。 这可能与本研究充分发挥针与电的双重作用，从而提高治疗效果有关。 本研究电针参数设置如下：疏密波，频率10 Hz，强度以保持肢体轻微震颤为度，时间30 min。 疏密波可以更加快速地清除自由基，促进脊髓损伤大鼠运动功能的恢复；而频率1～100 Hz 疏密波可以有效促进局部组织血液循环，改善神经组织营养，提高新陈代谢，促进炎症吸收。 这与张尧等［16-18］研究结果一致。此外，本研究采用电针针刺悬钟穴、阳陵泉穴，这2个穴位均分布于足少阳胆经，属于八会穴，分别是筋与髓的精气汇聚之处。 针刺这2 个穴位可以有效激发脏腑经络之气，促进气血流通，濡养经脉，从而缓解肌肉痉挛，改善肢体运动功能障碍［19］。这与陈向华等［20］研究结果一致。

4 小 结

本研究证实电针阳陵泉穴、悬钟穴干预SCII，对脊髓组织具有良好的保护作用，而这可能是通过介导免疫炎症反应发挥作用，其具体作用机制可能是在特定时间点电针通过上调IL-1Rα 的表达，降低TNF-α、IL-1β 及IL-6 的水平，从而发挥对脊髓组织的免疫保护作用。 这可为临床早期开始治疗SCII 提供一定的理论依据。