CAR-NK 细胞治疗乳腺癌的研究进展

杨玉兰，梁俊青，郭伟春，臧智超，王浩然

（内蒙古医科大学附属人民医院科研部，内蒙古 呼和浩特）

0 引言

根据国际癌症研究机构（IARC）发布的最新《全球癌症报告》显示，2018年全球乳腺癌发病率达24.2%，死亡率达15%，在女性恶性肿瘤中仍位列首位，同时也是女性因癌症死亡的首要原因，严重危害女性健康[1]。乳腺肿瘤微环境具有免疫抑制作用，在肿瘤发生中发挥重要作用。随着对恶性细胞和免疫细胞之间相互作用的深入了解，使研究人员能够利用新的免疫治疗策略来控制免疫系统。关于乳腺癌免疫治疗的研究也越来越受到重视，其中许多策略已经在乳腺癌方面显示出了前景。

快速发展的嵌合抗原受体（chimeric antigen re-ceptor，CAR）修饰T细胞在治疗恶性肿瘤，特别是血液系统恶性肿瘤方面取得了巨大的成就[2-5]。近几年，研究人员通过不断探索优化CAR-T细胞疗法，在临床各类型肿瘤治疗上取得了良好效果。与此同时，同样源于强大免疫系统的NK细胞也不容小觑。目前，也已经有很多基础和临床实验人员在研究如何构建高效的CAR-NK，CAR-NK细胞过继免疫治疗的潜力正逐渐被挖掘。现将 CARNK 细胞疗法的发展及其在治疗乳腺肿瘤方面的一些相关研究进展作一综述。

1 CAR-NK 细胞概述

1.1 CAR 修饰的T 细胞和NK 细胞概述

CAR的概念最早是由 Gross 等[6]在1989年提出，之后利用CAR构建的T细胞研究得到了迅速发展，特别是在血液肿瘤方面。美国食品和药物管理局（Food and Drug Adminis-tration，FDA）已经批准其作为某些白血病和淋巴瘤的治疗手段应用于临床[7-8]。此外，美国食品药物监督管理局分别在2017 年 8 月、10 月批准将 tisagenlecleucel[9]和 axicabtageneciloleucel[10]两项CAR-T疗法用于肿瘤治疗，这两项研究成果的成功应用，使2017年在CAR-T 发展进程中具有了重大意义。

据报道CD19靶向的CAR-T细胞在急性淋巴细胞白血病患者中的完全应答率为70%至90%[11]。然而，CAR修饰的T细胞对实体瘤的治疗效果比较差[12-14]。此外，CAR-T 细胞治疗也存在着一些如细胞因子风暴、脱靶效应、CAR-T 细胞的制备周期长以及基因突变等风险[15,16]。由于CAR-T 临床应用的限制和各种副作用，用CAR模式构建的NK细胞被认为是更有治疗恶性肿瘤的潜力[17],特别是对于治疗一些实体肿瘤，有可能比CAR修饰的T细胞治疗效果更好。

与表达CAR的T细胞相似，CAR修饰的NK细胞在体外和体内都表现出了更好的肿瘤特异靶向性和对癌细胞的细胞毒性[18-19]。NK细胞在基于CAR的免疫疗法中具有许多优势，例如，由于异基因NK细胞不会引起移植物抗宿主反应（GVHD），也无需人类白细胞抗原（HLA）匹配[20]，所以也可被用作效应细胞。此外，因为CAR-NK细胞通常不会诱导细胞因子风暴且较少引起脱靶效应，因此可能比CAR-T细胞更安全。CAR-NK细胞除了CAR介导的靶向杀伤之外，还可以通过NK细胞自身的抗肿瘤特性，识别并杀伤CAR靶标下调或缺失的肿瘤细胞，提高免疫治疗效果。另外，NK细胞有许多不同的来源，如外周血（PB）、人类胚胎干细胞(HESCs)、脐带血(UCB)、诱导多能干细胞(IPSC)，NK-92细胞系[20]等。在最新的一项研究中，小组人员在卵巢癌异种移植小鼠模型中测试了源自人类IPSC的CAR-NK细胞，并比较了它们与其他来源NK细胞、CAR-T细胞的抗肿瘤活性。结果表明，IPSC来源的CAR-NK细胞CAR4-iPSNK具有与CAR-T细胞相似的杀伤活性，但毒性较低。由此可推测，包括乳腺癌在内的实体肿瘤和白血病等血液肿瘤也可能是其潜在的治疗目标[21]。同时，最近由IPSC衍生的靶向多种抗原的CAR-NK细胞药物FT596已经被FDA批准进行临床研究，这表明CAR-NK免疫疗法对于肿瘤治疗的安全性和可靠性。

1.2 CAR 的结构

经过CAR构建的NK细胞，可以提高免疫细胞的靶向性，高效的识别肿瘤细胞，并通过释放杀伤介质、诱导细胞凋亡等多种方式杀伤肿瘤细胞。CAR结构主要是由三个功能域组成，即胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。胞外结构域由识别并结合抗原的单克隆抗体的单链可变片段（scFv）及一段起连接作用的铰链区构成。跨膜结构域可以将胞外结构域和胞内信号转导结构域连接起来，并可以将受体锚定到免疫细胞。胞内结构域由共刺激结构域和信号转导结构域构成[22]。

第一代CAR于1989诞生，目前为止，CAR结构已发展到第四代。第一代细胞内结构域仅含有 CD3ζ 链，体内存活时间较短; 第二代在第一代的基础上加入了共刺激域（如 CD28、4-1BB、CD134和 ICOS）,使免疫细胞抗肿瘤活性明显增强;第三代CAR结构包含一个 CD3ζ 链和两个或多个不同共刺激分子，可使免疫细胞持续活化增殖，增强杀伤肿瘤细胞作用; 第四代则加入了细胞因子或共刺激配体[23]，从而使修饰过的免疫细胞的增值活性和寿命得到了很大提升。CAR-NK的设计思路和基本框架是通过借鉴CAR-T细胞的构建而设计的，但其也有一些特有的个性化设计。例如，筛选了DNAX相关蛋白12( DNAX-associated protein 12，DAP12) 和DAP10为胞内信号传导结构域，DAP12可能比CD3ζ 能更有效地激活NK细胞信号传导。目前已经有研究人员开发了包含自然杀伤组2，成员 D( Natural killer group 2，member D，NKG2D) 的胞外结构域，NKG2D 作为自然杀伤细胞的表面受体，在多种肿瘤中都有其配体的表达。此外，有研究显示CARNK细胞对广谱肿瘤细胞亚型具有较强的杀伤毒性，这些个性化设计对急性淋巴细胞白血病、骨肉瘤、横纹肌瘤细胞和前列腺癌等恶性肿瘤细胞系都有很好的杀伤效果[24]。

tran等人报道第一个用于NK细胞的CAR是CD4-CD3ζ(CD4ζ)融合受体[25]。在本研究中，CD4ζ 嵌合受体具有生物化学和功能活性，可以有效地引导人NK细胞在体外杀伤表达gp120蛋白的艾滋病病毒（HIV）感染的CD4+T细胞或NK耐药肿瘤细胞，这表明CAR结构可以成功表达在NK细胞上，从而实现高效的重定向[25]。随后，采取了更多的探索试验来增强NK细胞的抗肿瘤能力。

2 CAR-NK 细胞治疗乳腺癌的研究进展

2.1 CAR-HER2 修饰的NK 细胞对乳腺癌细胞的杀伤

研究[26-27]发现，大约30%的乳腺癌患者过表达抗人表皮生长因子受体2( HER2 )基因。目前临床上广泛应用的抗乳腺癌的药物曲妥珠单抗，被证实对高度表达HER2 的乳腺癌细胞具有很好的抑制作用[28]。然而曲妥珠单抗在单用药时仅对低于35% 的高表达HER2基因的乳腺癌患者有效[29]。且有许多HER2阳性乳腺癌患者会出现对曲妥珠单抗等靶向药物耐药现象[30]。因此，HER2-CAR修饰的NK细胞免疫治疗成为了研究热点。

靶激活NK-92（taNK）细胞与另一种用CARs修饰的NK-92细胞的工程突变体，已经被设计用来靶向杀伤表达肿瘤相关抗原(TAAs)的肿瘤细胞[31,32]。有研究表明，用HER2-CAR（CD28-CD3ζ）修饰的NK 细胞和 NK92 细胞系对HER2阳性的乳腺癌、卵巢癌和上皮细胞癌等肿瘤细胞系的杀伤作用明显增强，并且在小鼠模型中能够有效减慢肿瘤的生长速度[33，34]。Liu等[35]人通过荧光激活细胞分选(FACS)在细胞表面上表达高水平融合蛋白的转导的NK-92-抗ErbB2 scFvCD28-ζ 细胞后, 发现这些细胞特异性地加快了表达ErbB2的人乳腺癌细胞系MDA-MB-453和SKBr3的细胞死亡。孔潇等[36]人使用 NK-92MI 细胞系，利用病毒转染的方试，将 HER2-CAR 构建到 NK-92MI 细胞上，然后在细胞水平以及乳腺癌原位动物模型实验中观察到了显著的靶向特异性，这表明，HER2抗原特异性CAR在一定程度上对HER2阳性的乳腺癌细胞具有较为明显的杀伤作用。HER2-taNK已经证明了taNK细胞稳定的CAR表达和活性，这种细胞系目前正在复发性HER2阳性胶质母细胞瘤患者中进行测试[37]。

2.2 表达PD-L1 的CAR-NK 细胞疗法临床进展

程序性死亡受体 1（PD-1）和程序性死亡受体配体 1（ PDL1）是近年来出现的一种新型免疫疗法[38]，通过阻断 PD-1/PD-L1信号通路进而使肿瘤细胞凋亡来实现治疗肿瘤的目的[39]。许多研究表明，PD-L1在在乳腺癌中处于高表达状态[40,41],因此，有研究人员提出利用表达PD-L1的CAR-NK细胞药物来进行临床试验。PD-L1.t-haNK细胞疗法是一种新颖的基于NK细胞的肿瘤免疫疗法，利用PD-L1特异性单链抗体片段被设计成一种特殊的CAR-NK细胞来介导抗体依赖性细胞毒作用。

2019年6月，纳斯达克上市公司NantKwest的PD-L1.t-haNK新药临床试验申请已经获得FDA批准，这是该项目在局部晚期或转移性实体瘤中的首次人体临床试验。PD-L1.t-haNK是表达靶向PD-L1的嵌合抗原受体的haNK细胞，haNK是公司专有的NK-92细胞系。这些细胞有两种主要的杀伤机制，即直接NK杀伤和PD-L1特异性杀伤。该疗法可以应用于与其他靶向方法结合使用[42]。

同年12月初， NantKwest宣布了其在CAR-NK治疗领域的部分临床实验结果，这项首次人体试验评估了该公司针对肿瘤局部晚期或转移性实体瘤的全球首创PD-L1.t-haNK细胞疗法的安全性和初步疗效。这些患者分别患有头颈部鳞状细胞癌、乳腺癌、结肠癌、胶质母细胞瘤、膀胱癌。试验显示，6名患者每次接受20亿个细胞的静脉输注，输注次数在9-23次之间，这些接受PDL1.t-haNK治疗的门诊患者均没有发生严重不良事件或剂量限制性毒性，均表现出了CAR-NK细胞药物较高的安全性，这表明CAR-NK疗法有可能克服CAR-T治疗实体瘤的局限性[43]。

2.3 CAR-NK 细胞与溶瘤病毒联合应用

溶瘤病毒（OV）是一类通过野生筛选或使用基因改造技术构建、能够在肿瘤细胞中选择性复制、溶解肿瘤细胞的病毒。之前的研究表明，OV的作用机制包括直接裂解肿瘤细胞、调节肿瘤微环境、募集肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）、启动先天免疫细胞和CD8+T细胞介导的免疫反应，以及调节血管生成。OV具有独特优势：经临床前研究证实具有广谱的抗肿瘤效果，对多种肿瘤都有效，且安全性出色。因此，溶瘤病毒在肿瘤治疗过程中的多功能特性使其具有与其他药物联用增效的巨大潜力。一项三阴性乳腺癌的临床前研究模型中显示，溶瘤马拉巴病毒可使难治性肿瘤对免疫检查点抑制剂的敏感性增强[44]。此外，用多种细胞因子武装的溶瘤病毒也被用于与CAR-T细胞疗法联合；在异种移植瘤模型中，这种联合策略也增强了抗肿瘤活性[45]。据此，可以设想将CAR-NK与溶瘤病毒联合起来治疗乳腺肿瘤。

在转移性乳腺癌患者中乳腺癌脑转移（B2BM）较常见，且预后较差。在最新的研究中发现，B2BM的关键机制涉及N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）,该受体存在于神经元的细胞膜上，并且参与传播神经冲动，NMDAR由在这种神经冲动的突触传递期间从突触前神经元释放的谷氨酸激活[46]。有研究显示，与单独使用CAR-NK细胞的疗法相比，第二代设计的表皮生长因子受体-CAR-NK细胞与溶瘤性单纯疱疹病毒（oHSV）的联合应用对乳腺癌细胞株具有更高的杀伤率，并在乳腺癌小鼠模型中可以有效抑制肿瘤扩散[47]。这可能为CAR-NK细胞联合溶瘤性病毒有效治疗其他耐药实体肿瘤提供了参考价值。

2.4 CAR-NK 细胞联合化疗

研究表明放化疗可上调肿瘤细胞表面 NK 细胞活化性受体配体的表达，提高肿瘤细胞的敏感性，进一步提高 NK细胞治疗缓解率[48]。紫杉醇（paclitaxel，PTX）是乳腺癌化疗中的基石方案，尤其是对于三阴性（TNBC）这类高危患者。在2018年的欧洲肿瘤内科学会（ESMO）上，有研究公布紫杉类联合免疫治疗对比单纯化疗可以显著提高患者疗效，并延长患者的总生存。这可以为CAR-NK联合化疗治疗乳腺肿瘤提供研究思路，同时，随着肿瘤免疫治疗研究的发展，利用免疫细胞作为载体直接将抗癌药物运送到肿瘤部位的概念受到了研究人员的关注。有研究报道，NK 细胞表面具有高水平的游离巯基[49]。Elizabeth L. Siegler等的研究显示，免疫细胞可以作为直接对肿瘤有细胞毒性的纳米粒子或携带化疗药物的纳米粒子的活性载体。纳米粒子可以通过直接利用氨基或巯基等官能团结合到肿瘤细胞表面，通过疏水作用、静电相互作用进入脂质双层或附加到特定的细胞表面受体。交联多层脂质体小泡（cMLV）是由硫醇反应的马来酰亚胺头部基团修饰的脂质体，可稳定地结合到NK细胞表面的还原巯基上。因此，CARNK细胞可促使包载PTX的cMLV进入肿瘤部位，有效减缓肿瘤生长，增加肿瘤内PTX浓度[50]。此研究证明，应用嵌合抗原受体工程的NK-92细胞作为载体，将载药纳米粒子直接导向靶点，在体外和体内试验都能提高乳腺癌化疗的疗效，同时也可减少非靶点毒性[50]。

3 CAR-NK 细胞免疫治疗的不足和挑战

虽然CAR修饰的NK细胞相对于CAR-T细胞的优势为其在难治性恶性乳腺癌细胞的免疫治疗中的应用提供了很大的希望，但目前也存在许多问题。首先，NK细胞上CARs的最优结构设计尚未得到系统研究。CAR结合表位的位置及其与CAR-NK细胞表面的距离可能会影响其与抗原的结合、免疫突触的最佳形成和CAR-NK细胞的激活[51]。此外，由于NK细胞的异质性，其包含有许多不同功能特征的不同NK亚群，而不同NK细胞亚群可能特异性地参与各种免疫反应和相关疾病易感性[52]。所以仍有待进一步探索选择何种NK细胞亚群来扩增和构建靶向杀伤乳腺肿瘤的CAR-NK细胞。

越来越多的研究者正在积极开发更有效的方法以提高NK细胞为基础的抗肿瘤免疫功能。体外扩增/激活技术的进步以及基因修饰NK细胞新方法的出现，使NK细胞的过继免疫治疗有望成为对抗恶性肿瘤的有力武器。此外，找到更好的联合治疗方案，找到更好的疗效预测指标，找到更好的副作用控制措施，也是CARNK治疗乳腺癌面临的新挑战。