EA-IL-15溶瘤腺病毒的构建及其对胶质瘤细胞特异性及有效性研究

季佳宇 王启俨 方 胜 田毅夫 刘福生 米蕊芳

胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性颅内肿瘤之一，其中约50%为恶性程度极高的胶质母细胞瘤。由于其具有广泛浸润性、血-脑脊液屏障的保护及局部和系统性的免疫抑制，在经过手术、放疗和化疗等综合治疗后其中位生存期仅为15个月[1，2]。溶瘤病毒疗法(oncolytic virus therapy)是一种很有前途的癌症基因治疗疗法，溶瘤病毒可以在恶性细胞中选择性复制，导致癌细胞裂解，同时释放肿瘤相关抗原(TAAs)、病原相关分子模式(PAMPS)和危险相关分子模式(DAMPS)刺激肿瘤细胞的适应性免疫反应[3,4]。

溶瘤腺病毒是最常见的溶瘤病毒之一，通过对相关基因的修饰或改造，溶瘤腺病毒可以在肿瘤细胞中进行特异性复制和裂解，引起炎性反应促进免疫应答[5]。在已经进行的临床试验中，溶瘤腺病毒显示出令人满意的安全性[6]。腺病毒具有高基因转导效率和遗传稳定性，其结构和基因功能已经有了比较完善的描述，对其进行修饰改造相对简单易行[7，8]。然而，由于实体肿瘤的结构复杂及肿瘤微环境的存在，溶瘤病毒难以完全发挥作用。

人内皮抑素(endostatin, Endo)和血管生成抑素(angiostatin, Angio)作为一种融合的结构调节分子Endo-Angio能够有效抑制血管内皮细胞增生。Endo-Angio 融合蛋白能够抑制胶质瘤等肿瘤中新生血管的生长，破坏肿瘤微环境，且能够抑制肿瘤细胞的增殖并极少产生耐药性[9]。有研究显示溶瘤病毒中插入人内皮抑素和血管生成抑素融合基因可以表达Endo-Angio 融合蛋白，能够显著抑制人脑微血管内皮细胞(HBMEC)的增殖[10]。

人白介素15(IL-15)是一种免疫调节分子，在淋巴细胞介导的肿瘤免疫应答过程中，IL-15可以促进T细胞增殖分化、B细胞相关抗体的分泌。有研究显示，在溶瘤性水疱性口炎病毒(VSV)中插入高分泌型hIL-15感染肿瘤细胞，被感染的CT-26肿瘤细胞局部表达IL-15 明显增强，导致T细胞的免疫反应增强[11]。本研究通过构建携带Endo-Angio、IL-15双基因的溶瘤腺病毒，研究其在体外对胶质瘤细胞是否具有明显的杀伤作用和特异性。

材料与方法

1.材料：GL261细胞和永生化的小胶质细胞系BV2购自中国医学科学院。人神经胶质瘤细胞系U251从北京细胞库获得。DMEM培养基、PBS磷酸盐缓冲溶液、胰蛋白酶和双抗(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)购自美国Gibco公司, 胎牛血清购自杭州四季青公司,CCK-8试剂盒购自日本Dojindo公司。溶瘤病毒载体由笔者实验室保存。

2.溶瘤腺病毒载体及插入EA-IL-15双基因的溶瘤腺病毒的构建：(1)溶瘤腺病毒载体(oAD)：去除腺病毒穿梭载体pXC1，在E1A区域添加survivin启动子，删除E1B区域的19kDa区域。(2)插入EA-IL-15双基因的溶瘤腺病毒(oAD-EA-IL-15)：PCR的方法将EA-IL-15双基因插入腺病毒穿梭载体pXC1，Endo-Angio基因和IL-15基因中间通过核糖体进入位点(IRES)连接，将穿梭质粒pXC1-EA-IL-15及辅助质粒pBHG loxΔE1, 3 Cre质粒共转染HEK393细胞，得到溶瘤腺病毒oAD-EA-IL-15。

3.细胞培养：GL261小鼠胶质瘤细胞和BV2小胶质细胞在常氧条件下用含有10%胎牛血清的DMEM、1%双抗的培养基置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。细胞用含有0.05%的胰蛋白酶液进行消化和传代。

4.细胞加药实验：取对数期细胞接种于96孔板中，培养24h，按照不同MOI值加入病毒感染，培养72h后观察细胞状态并定量分析细胞的相对活性。

5.CCK-8细胞毒性实验：病毒感染72h，取出96孔板，每孔加入10μl CCK-8溶液，37℃培养箱内孵育2h，酶标仪测定450nm处的吸光度。

结 果

1.构建溶瘤腺病毒载体(oAD)：去除腺病毒穿梭载体pXC1，在E1A区域添加survivin启动子，使其对肿瘤细胞具有特异性感染；删除E1B区域的19kDa区域，使得病毒获得诱导肿瘤细胞凋亡的能力，并增加腺病毒的传播能力，构建成溶瘤腺病毒载体(oAD)。体外病毒包装得到空载溶瘤腺病毒oAD。

图1 倒置显微镜下观察空载溶瘤腺病毒(oAD)对胶质瘤细胞GL261形态的影响(×100)A.对照组；B.MOI=10 oAD处理组；C.MOI=100 oAD处理组

2.溶瘤腺病毒oAD对胶质瘤细胞的体外杀伤作用及特异性研究：溶瘤腺病毒oAD感染胶质瘤细胞GL261，72h后倒置显微镜下观察，可见对照组细胞贴壁生长，排列规则，细胞密度大。实验组中随着MOI值的增高，细胞密度减少，细胞形态皱缩，详见图1。说明oAD对GL261细胞有一定的杀伤作用。将oAD同时作用于GL261细胞及小胶质细胞BV2(非肿瘤细胞)。感染72h后测定细胞相对活性，可以看到与对照组(PBS)比较，oAD对GL261具有明显的杀伤作用(P<0.05)，并且在不同MOI值病毒的作用下，oAD对GL261的杀伤作用明显高于对BV2，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)，详见图2。

图2 空载溶瘤腺病毒(oAD)特异性及有效性分析与对照组比较，*P<0.05；GL261与BV2比较，#P<0.05

3.构建插入EA-IL-15双基因的溶瘤腺病毒(oAD-EA-IL-15)：为了增强溶瘤病毒对胶质瘤细胞的杀伤作用，笔者将Endo-Angio及IL-15基因定向克隆构建到溶瘤腺病毒oAD的腺病毒穿梭载体pXC1中，构建成EA-IL-15双基因腺病毒载体pXC1-EA-IL-15。PCR的方法检测所插入的基因，可见挑取的8个克隆株中有7个携带有EA-IL-15基因，详见图3。Endo-Angio基因和IL-15基因中间通过核糖体进入位点(IRES)连接，可同时表达，详见图4。笔者进一步将穿梭质粒pXC1- EA-IL-15及辅助质粒pBHG loxΔE1, 3Cre质粒共转染HEK393细胞，得到溶瘤腺病毒oAD-EA-IL-15。

图3 插入EA-IL-15双基因转化子PCR鉴定分析1.空白对照组；2.阴性对照；3.阳性对照；4.250bp DNA Ladder(自上至下：5kb、3kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp)；5～12.1～8号克隆转化子

图4 插入EA-IL-15双基因的腺病毒穿梭载体pXC1结构

4.插入EA-IL-15双基因的溶瘤腺病毒(oAD-EA-IL-15)对胶质瘤细胞的体外杀伤作用及特异性研究：统一两病毒效价，将oAD-EA-IL-15及oAD溶瘤病毒分别感染GL261细胞，感染72h后测定细胞的相对活性，绘制剂量反应曲线。可见随着溶瘤病毒浓度的增加，GL261细胞相对活性不断下降。说明两种溶瘤病毒对GL261细胞均有杀伤作用(P<0.01)，其中oAD-EA-IL-15对GL261细胞的杀伤作用明显优于oAD(P<0.01)，详见图5。oAD-EA-IL-15对GL261细胞的半抑制浓度(IC50)值为0.58×107±1.30×105PFU/ml，低于oAD的IC50值1.13×107±1.98×105PFU/ml(P<0.01)，说明oAD-EA-IL-15对肿瘤细胞的杀伤作用强于oAD。

图5 双基因溶瘤腺病毒对小鼠胶质瘤GL261细胞作用分析与对照组比较，*P<0.01；#P<0.01

将oAD-EA-IL-15及oAD溶瘤病毒分别感染小胶质细胞(非肿瘤细胞)BV2。72h后在不同剂量下测定细胞的相对活性，详见图6。可以看到oAD-EA-IL-15(P<0.05)对其活性的影响低于oAD(P<0.01)。在病毒效价同为108PFU/ml时，oAD-EA-IL-15感染下的BV2细胞相对活性高于 oAD (P<0.01)，说明oAD-EA-IL-15病毒的特异性优于oAD病毒。

图6 双基因溶瘤腺病毒特异性分析oAD及oAD-EA-IL-15病毒对BV2细胞的作用。与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；#P<0.01

讨 论

笔者在构建溶瘤腺病毒载体的时候选择在E1A区添加特异性启动子，特异性的肿瘤组织启动子可以控制病毒增殖必需基因的表达，从而获得病毒对肿瘤细胞的选择性复制[12]。肿瘤特异性启动子包括survivin启动子、环氧化酶(COX-2) 启动子、hTERT启动子等。笔者选用的survivin启动子在80%的胶质母细胞瘤肿瘤细胞中有丰富的表达，且其阳性肿瘤样本的比例与胶质瘤的组织学分级存在明显的相关性[13]。此外，笔者还删除了E1B-19k区域，该区域所编码产物功能类似于抗凋亡因子Bcl-2可以抑制Bax和TNF发挥抗凋亡作用，19k的缺失能够协同溶瘤腺病毒在肿瘤细胞中特异性复制，增强病毒传播能力[14]。在溶瘤腺病毒载体的基础上笔者补充了结构调节基因Endo-Angio和免疫调节基因IL-15，希望病毒本身的溶瘤作用和外源基因的治疗作用协同，增强病毒的扩散及对肿瘤的杀伤能力。

在体外实验中可见，oAD-EA-IL-15和oAD对于肿瘤细胞均具有特异性的杀伤效果。对于肿瘤细胞，oAD-EA-IL-15的杀伤效果更好，对于非肿瘤细胞，oAD-EA-IL-15有更好的特异性，在溶瘤病毒的体内治疗过程中，更好的特异性就意味着更好的安全性，加强患者的预后。

在面对体内的实体肿瘤中，肿瘤中存在不支持溶瘤腺病毒的复制的缺氧区域、相关成纤维细胞的积累、致密的细胞外基质和新生血管的形成都可以阻碍溶瘤腺病毒的传播[8]。对此，通过构建携带Endo-Angio基因的溶瘤腺病毒，来达到抑制新生血管形成的作用，一方面在结构上减少实体肿瘤的复杂程度；另一方面减少肿瘤组织的血供，导致未感染的肿瘤细胞凋亡(旁观者杀伤效应)，从而抑制肿瘤的生长[15]。肿瘤周围还有肿瘤微环境，其中往往含有对溶瘤病毒有杀伤作用的自然杀伤(natural killer，NK)细胞，阻碍溶瘤病毒扩散的肿瘤基质等非肿瘤细胞、可以抵消溶瘤腺病毒免疫刺激优势的Tregs、MDSCs等抑制性免疫细胞[16]。IL-15是NK细胞、自然杀伤类细胞以及CD44高表达CD8+T 细胞激活的必需因子，通过活化NK细胞可以增强抗肿瘤活性，且不会增加Tregs细胞的数量和活性[17，18]。IL-15还可以通过调节肿瘤微环境的组织间隙来促进溶瘤病毒的扩散，并且可以增加血管抑制性药物的抗血管作用[19]。

综上所述，本研究成功构建了溶瘤腺病毒载体(oAD)及oAD-EA-IL-15溶瘤病毒，并且体外实验的结果表明，oAD-EA-IL-15溶瘤病毒对胶质瘤细胞GL261有明显的杀伤作用，同时具有一定的特异性。本研究为oAD-EA-IL-15溶瘤病毒对胶质瘤及其他实体肿瘤的治疗研究提供了良好的实验依据。