光纤记录丙泊酚全身麻醉过程中黑质网状结构神经元活动

金 迪 于布为

现代麻醉发展至今已有200年历史，丙泊酚作为目前临床上使用最广泛的静脉麻醉药之一，通过激动GABAA受体产生神经系统的抑制作用[1]。丙泊酚不仅广泛用于各类外科手术的麻醉诱导和维持，也在有创、内镜检查中发挥着重要作用。以其为代表的一些全身麻醉药物在麻醉诱导时，缓慢增加麻醉药血药浓度，患者会出现反常兴奋现象，表现为欣快或烦躁、胡言乱语、无意识动作增加，与麻醉药的血药浓度缓慢增加有关[2～5]。若给予较大的麻醉剂量快速注射，则这个过程会被掩盖[6, 7]。因此，揭示反常兴奋的大脑机制，有助于进一步理解全身麻醉药物的作用机制。

基底神经节在大脑调节各种生理活动中起到至关重要的作用，感觉皮质-丘脑-基底神经节-皮质这一通路与奖惩、复杂运动的协调等高度相关[8～10]。与黑质致密部(substantia nigra pars compacta， SNc)的多巴胺能神经元不同，黑质网状结构作为基底节重要的运动相关输出核团，主要分泌GABA这一类抑制性神经递质[11，12]。本研究使用了Gad2-ires-cre品系的转基因小鼠，特点是在抑制性的GABA能神经元中表达Cre重组酶，通过立体定位在黑质网状核注射腺相关病毒(pAAV-hSyn-flex-GCamp6f-WPRE-SV40pA)并植入光纤，待感染了神经元并表达了钙荧光指示蛋白GCamp6f后，使用光纤记录系统，探讨自由活动小鼠SNr的GABA能神经元胞体活动及在腹腔注射丙泊酚或0.9%NaCl注射液后神经元集群钙信号的变化情况。

前期实验发现，在经过大于2h的手术麻醉后，小鼠在4周后再给予丙泊酚麻醉所需剂量远大于未经过手术的小鼠，因此模拟实验条件，通过旷场实验中小鼠的行为活动确定实验所需的最适丙泊酚腹腔注射剂量。

材料与方法

1.材料：(1)实验动物：C57BL/6小鼠8只(雌雄各4只)，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。Gad2-ires-cre转基因小鼠8只，8周龄，由清华大学实验动物中心繁育。(2)主要仪器：小动物麻醉机(美国Harvard Animal Anesthesia system公司)；高分辨率体视显微镜(德国Leica公司)；单轴显微操作器/液压(日本Narishige公司)；电动微型机械手(美国Sutter公司)；体式荧光显微镜(日本Olympus公司)、全自动振动切片机(德国Leica公司)；光纤记录系统(南京千奥星科)。(3)主要试剂：pAAV-hSyn-flex-GCamp6f-WPRE-SV40pA(泰尔图；该病毒为AAV-腺相关病毒，hSyn-携带啮齿类动物神经元蛋白表达的启动子，flex-条件性基因表达载体，在Cre重组酶的作用下激活目的基因的表达，GCamp6f-携带钙指示蛋白的增强型绿色荧光蛋白)；4%多聚甲醛(PFA，美国Sigma公司)；异氟烷(深圳瑞沃德)；丙泊酚注射液(英国AstraZeneca UK Limited公司)。

2.旷场实验评估丙泊酚麻醉效果：8只8周龄C57BL/6小鼠，随机分为两组，即35mg/kg注射剂量组和50mg/kg注射剂量组。为模拟光纤手术需接受的麻醉暴露条件，将小鼠放入麻醉诱导箱(尺寸：20cm×20cm×15cm)中，给予1.5%异氟烷混合60%氧气，持续2h，气体流量为0.6L/h，实验过程中使用动物保温毯维持体温，4周后进行旷场实验。将浓度为10mg/ml丙泊酚注射液用5%葡萄糖溶液稀释成5mg/ml，称量小鼠的体质量，计算注射剂量进行腹腔注射。注射完成后放入搭建好的实验平台开始视频记录(图1A)，每只小鼠记录10min。分析小鼠10min内的活动状态(如翻正反射是否消失)及移动距离和速度情况，评估丙泊酚麻醉效果。

3.病毒注射：使用3%异氟烷将Gad2-ires-cre转基因小鼠诱导麻醉，固定于立体定位仪上，降低异氟烷浓度为1.0%～1.5%，氧气流量0.6L/h，手术全程使用动物保温毯维持温度。将小鼠覆盖头顶的毛发剃除，剪开头皮充分暴露颅骨，并将附着在头骨上的软组织刮除，保证头骨表面无毛发、黏膜、血液，用棉签擦干表面。根据骨缝定位Bregma点和Lambda点，调整小鼠头部前后、左右处于水平位置。根据小鼠脑区立体定位坐标系图谱以Bregma点为原点定位病毒注射位点[图1B；轴向距离AP:-3.20；水平距离ML:±1.5；深度DV:4.60；单位为毫米(mm)]，用电钻打磨至暴露硬脑膜。将拉制好的玻璃电极充满矿物油，安装在显微操作器上，缓慢吸取适量病毒后固定在立体定位仪上，定位至注射位点上方。缓慢下降，以电极尖端接触硬脑膜平面为零面，下降电极至深度4600μm。以10nl/min的速度缓慢注射病毒，共计100ml，等待10min。病毒注射时，观察电极液平面缓慢下降，证实病毒顺利注入。

4.光纤陶瓷插芯植入:实验使用直径200μm的光纤陶瓷插芯(数值孔径为0.37)，手术前先进行透光率测试。黑暗环境下设置激光功率测量仪检测波长为480nm，根据测量仪示数调整光纤记录仪器输出功率至40μW。使用连接器将光纤陶瓷插芯安装在光纤跳线，保证二者同轴后记录测量仪示数，在示数达到32μW以上即透光率达到80%光纤陶瓷插芯才可用于实验。使用夹持器固定好光纤陶瓷插芯，缓慢植入至硬脑膜下4.55mm(图1B)，使用氰基丙烯酸胶涂抹在周围颅骨及皮肤和头骨相接处，待胶水干燥后，使用牙科水泥加固。术后皮下注射氟美林0.3ml，连续3天，待小鼠清醒后放回原笼饲养。

5.光纤钙信号记录:在避光环境下，打开光纤记录系统，等待基线稳定。实验前称量小鼠体质量计算腹腔注射剂量，将小鼠放入在透明实验箱中适应10min后，记录原始基线幅值后进行光纤记录，同时视频记录小鼠行为。清醒状态下记录小鼠5min后，腹腔注射0.9%NaCl注射液/丙泊酚溶液，观察小鼠行为变化，标记出现翻正反射消失(loss of righting reflex, LORR)和翻正反射恢复时间，待恢复后再记录5min，其中，翻正反射消失的定义标准为：调整小鼠姿态为仰卧位后在10s内无法恢复立位。

6.心脏灌流和脑组织切片:记录完成后，用0.3%戊巴比妥溶液，按体质量以0.2ml/10g计算剂量进行腹腔注射，5～10min左右通过掐尾观察有无体动反应判断麻醉深度。在剑突下剪一适当切口，沿胸廓两侧打开胸腔，暴露出心脏。灌流管路预先充满PBS溶液，针尖插入左心室向主动脉方向进针约3～4mm，固定针尖，剪开右心耳，PBS灌流至无血液流出后，更换灌洗液为4%PFA，固定脑组织。灌流结束后，剥除颅骨取脑，浸入4%PFA再固定24h后，预处理后 2%琼脂糖包埋，振荡切片机做冠状位组织切片，厚度为100μm。通过与小鼠脑图谱匹配，确定SNr的位置，使用1000×DAPI染料浸没脑片染色3min，然后摇床PBS冲洗3次，每次5min，待干后使用抗荧光衰减剂封片，荧光显微镜下观察、拍片。

结 果

1.腹腔注射丙泊酚剂量确定：视频分析发现，腹腔注射丙泊酚的剂量不同，两组小鼠在10min的移动距离、中心点平均速度及丙泊酚产生的镇静效果方面的表现差异很大(表1)。35mg/kg组小鼠在腹腔注射丙泊酚约30s会出现行为活跃性增加的现象，具体表现为运动速度增加、左摇右晃步态且伴有频繁的前/后肢的搔抓。该组小鼠都未出现翻正反射消失，并在6～7min左右步态恢复。50mg/kg组小鼠同样在30s左右出现了活跃性增加的现象，但与35mg/kg组小组比较，小鼠的移动距离和速度降低(P<0.05)，在4min左右出现了翻正反射消失，持续约90s。

图1 实验装置A.旷场实验；B.病毒注射及光纤植入的模式图；C.光纤记录系统模式图

2.光纤钙信号记录:对自由活动小鼠的黑质网状结构的GABA能神经元进行光纤记录，发现在清醒状态下神经元呈非同步、运动相关发放。在行动时，钙活动水平低，而在静止不动时神经元发放幅值大，而在麻醉状态下神经元则以一定节律同步发放，且幅值减弱(图2)。

腹腔注射0.9%NaCl注射液并没有引起SNr神经元钙活动的改变，而给予丙泊酚50mg/kg剂量注射后，GABA能神经元的活动随小鼠的状态发生了明显的改变。腹腔注射完成1min后，小鼠出现反常兴奋，伴随每一次搔抓前肢，钙信号幅值增大。随着镇静水平的加深，小鼠的活动减弱至翻正反射消失，待苏醒后，前期小鼠的活动少，记录到的神经元钙信号增加(图3)。

表1 不同剂量丙泊酚麻醉诱导表现

图2 自由活动小鼠的光纤钙信号记录结果A.清醒状态下；B.麻醉状态下

图3 单次腹腔注射丙泊酚麻醉诱导/生理盐水的光纤钙信号记录A.腹腔注射0.9%NaCl注射液;B.腹腔注射丙泊酚，红色矩形框中为翻正反射消失到恢复一段时间，即为“意识丧失时期”

3.病毒表达及光纤轨迹:从脑组织冠状切片看，匹配小鼠脑图，GCamp6f在SNr区域稳定表达，且光纤记录位点正处于神经元集群内(图4)。

图4 SNr神经元的GCamP6f表达荧光显微镜下所摄冠状脑片，类椭圆形区域为SNr，矩形区域为光纤植入轨迹，比例尺为500μm。绿色荧光为GCamP6f表达，蓝色为DAPI染色显示神经元分布

讨 论

本研究使用Gad2-ires-cre品系的转基因小鼠，通过使用Cre重组酶依赖的GCaMP6f病毒特异标记黑质网状结构的GABA能神经元，然后利用光纤钙信号记录系统，监测SNr核团抑制性神经元的钙活动，探索丙泊酚麻醉诱导出现的反常兴奋期、翻正反射消失状态下SNr的活动情况。

临床麻醉过程中，以丙泊酚、依托咪酯和七氟醚为代表的全身麻醉药物在患者的麻醉诱导阶段会出现与镇静目标相悖的行为状态，其表现出的无意识的肢体动作增加与基底神经节可能相关[13]。基底神经节中黑质核团可根据功能和结构的不同，分为黑质致密部和黑质网状结构。黑质致密部神经元分泌多巴胺，与奖赏的神经调节有关，而SNr神经元主要合成GABA这一种抑制性神经递质，投射到丘脑参与复杂运动的调控[14,15]。全身麻醉药物的分子机制研究结果表明，几乎所有的全身麻醉药物都可通过激动GABAA受体抑制神经元，并以丙泊酚为代表。

本研究采用立体定位注射的方法向黑质网状结构注射Cre重组酶依赖病毒，实现在SNr核团的GABA能神经元表达GCaMP6f。由脑组织冠状切片结果观察，笔者成功标记了SNr核团的神经元，与文献中报道的GABA神经元分布情况相似[16]。光纤记录系统对于研究自由活动的动物行为状态有其独特的优势[17]。相比较而言，电生理记录因为其复杂的记录系统和操作，其更适用于固定小鼠，且虽然其能够采集单个神经元的电信号活动，却没有细胞特异性，而光纤钙信号记录则可以通过转基因小鼠的选择和病毒注射以实现采集特定的神经元信号，这对于研究深部脑区的神经元集群活动在清醒-麻醉转换有着广阔的前景[18，19]。

在清醒状态下，黑质网状结构的神经元钙活动在自由活动的小鼠中呈现与运动相关发放。小鼠移动时，钙基线稳定，若静止不动、前后肢搔抓等行为，则钙活动增强这与之前的研究结果一致，同时再次验证记录的有效性[20]。对小鼠进行丙泊酚麻醉诱导，钙活动水平会随着“反常兴奋”期的出现而增强，而当翻正反射消失后，钙活动减弱。腹腔注射丙泊酚引起的麻醉时效短，与丙泊酚药物代谢快相关，也可能与小鼠经过多次麻醉后出现了耐受有关。在麻醉恢复后，小鼠会出现嗜睡现象，SNr的神经元钙活动也相应增强。

综上所述，本研究通过对转基因小鼠进行病毒注射，特异性标记黑质网状结构的GABA能神经元表达钙指示蛋白，成功利用光纤钙成像技术记录了丙泊酚全麻诱导后神经元活动。目前的研究结果发现,SNr的GABA神经元在清醒-麻醉-苏醒过程，其钙活动水平会出现先增强后减弱再增加的现象。在反常兴奋期中GABA能神经元的活动增强可能驱动小鼠从反常兴奋期向麻醉状态过渡。