单克隆抗-CD38抗体对红细胞血型血清学检测的干扰及解决方法现状

邵林楠 于卫建 周世航

多发性骨髓瘤（MM）是一种浆细胞克隆性增殖的血液系统恶性肿瘤[1]。在骨髓瘤细胞表面有一种高表达的跨细胞膜糖蛋白：CD38分子，在红细胞、正常淋巴细胞和骨髓细胞中仅少量表达，因此CD38分子可作为 MM治疗的新靶点[2]。

自2015年全球第一款单克隆抗-CD38抗体（Daratumumab，被译为达雷妥尤、达雷木或达拉木）在美国获批上市以来，它的高效性和良好的安全性使得其被广泛应用于治疗复发难治性多发性骨髓瘤[3,4]。2019年7月，中国国家药品监督管理局批准达雷妥尤上市，为我国MM患者带来福音。与此同时，更多的单克隆抗-CD38抗体（Isatuximab、MOR202和TAK079等）也在积极的进行临床实验中[5]，不久的将来，可能会批准用于MM的治疗中。

由于多种因素影响，大部分MM患者会出现贫血症状，输血用于治疗MM贫血，起效较快，可迅速达到纠正贫血的目的。但是很早人们已经认识到，达雷妥尤会在间接抗球蛋白试验（IAT）中产生泛凝集（pan agglutination）现象而干扰交叉配血等相关试验[6]。同样的，Isatuximab及MOR202也被发现可以产生类似的干扰[7]。

随着单克隆抗体治疗的日益普及，输血实验室收到此类患者血液标本的可能性也随之增加，为输血服务带来重大挑战。本文将结合已发表的临床文献资料，综述国内外解决这一问题的各种方法，最后提出优化输血管理的建议。

1 CD38分子 CD38分子是一种长46kDa的单链II型跨膜糖蛋白，编码基因位于4号染色体（4p15）上，由一个短的（20个氨基酸）N端胞质尾和一个长的（256个氨基酸）胞外结构域组成[8,9]。CD38抗原早在1980年由美国学者用单克隆抗体在人类淋巴细胞表面探索T细胞受体时被发现，最初被作为胸腺细胞和活化T细胞标记物（T10，现在的CD38）[10,11]。它的生物学功能包括胞外酶活性、细胞内钙调节与受体介导的粘附等[12]。CD38分子不但表达于前列腺上皮细胞、胰岛细胞、一些神经元的核周和树突、肾小管、视网膜神经节细胞和角膜细胞等组织中[13-15]， 还表达于浆细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、红细胞和血小板上[16]。由于CD38分子在骨髓瘤细胞表面高表达，而在红细胞、正常淋巴细胞和骨髓细胞中仅少量表达，因此CD38分子已经成为MM治疗的新靶点[2]。

2 抗-CD38抗体 常见的单克隆抗-CD38抗体作用机制见表1。TAK-079不仅用于治疗MM患者，而且也被尝试用于治疗自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮[17]。在体外对比试验中，与Isatuximab、MOR202和TAK-079等单抗相比，达雷妥尤在低浓度下诱导CDC的效果最好；上述抗-CD38单抗均能诱导ADCC；与MOR202相比，达雷妥尤和TAK-079单抗对ADCP诱导作用更强[18]。除此之外，一些用于治疗MM的免疫毒素及双特异性抗体也正在研究试验中，如抗-CD38 抗体HB7与化学修饰的蓖麻毒素分子结合的免疫毒素、抗-CD38单抗IB4偶联1型核糖体失活蛋白（saporin-S6）组成的免疫毒素以及双特异性GBR-1342抗体（靶向CD38和CD3）等[19-21]。

3 单克隆抗-CD38抗体对红细胞血型血清学检测的干扰早期研究发现，达雷妥尤使常规IAT均产生泛凝集现象，包括运用IAT进行的不规则抗体筛查及鉴定、红细胞抗原表型分析和交叉配血试验等[6,7]。这是由于达雷妥尤与献血者/试剂红细胞表面CD38结合，再加入抗体球蛋白试刘，通过桥连作用产生凝集现象（图1）。这种泛凝集一般较弱，通常为1+左右，这是由于达雷妥尤与献血者/试剂红细胞表面CD38结合引起的，停药后6个月之内仍可观察到IAT泛凝集现象[6,7,28]。但是，达雷妥尤不会对直接离心法结果造成干扰，如检测患者ABO、RhD血型、盐水介质交叉配血等。

表1 常见的抗-CD38单抗及作用机制

4 解决单克隆抗-CD38抗体干扰的方法 达雷妥尤对IAT方法的干扰可能导致额外不必要的检测，并延长交叉配血所消耗的时间，使患者贫血状态不能及时得到纠正，特别是在操作人员不知患者使用了达雷妥尤的情况下，进行交叉配血或者不规则抗体筛查、鉴定时会认为存在特异性抗体。而且临床上有意义的同种抗体可能会被泛凝集所掩盖，给患者带来急性或延迟性输血反应的风险。为了克服达雷妥尤对输血医学造成的干扰，国内外学者介绍了以下几种解决方案。

4.1 直接使用凝聚胺法：凝聚胺是一种高价阳离子聚合物、肝素中和剂，可以引起可逆的、非特异性的红细胞凝集，促进红细胞抗体的检测。此法可以检测绝大部分具有临床意义的血型抗体包括IgG和IgM，但是对抗-K敏感性低[29]。因为中国乃至东南亚地区人群K抗原极低，抗-K抗体非常罕见。而在其他人种中K抗原相对常见[30]，使用凝聚胺的方法可能造成抗-K抗体漏检从而给输血带来风险，所以凝聚胺法逐渐被其他方法取代甚至被抛弃，在欧美等地区没有真正流行起来。但是凝聚胺在国内及东南亚地区使用较为普遍[31]，因为几乎可以不用考虑抗-K的缘故。我国台湾地区也使用凝聚胺法进行交叉配血试验，而且发现使用达雷妥尤患者在进行聚凝胺法交叉配血时无干扰发生[32]。

4.2 输注主要血型抗原同型红细胞：在使用达雷妥尤治疗前，对患者进行红细胞表型和基因型分型对于后期输血时提供相容性红细胞是非常有效的。患者输注与自身表型相近的红细胞可以降低红细胞同种抗体的产生[33]。患者红细胞表型应在患者开始使用单克隆抗-CD38抗体治疗之前并在末次输血后至少3个月（否则可能产生误导性结果）期间进行鉴定[34]。红细胞抗原的基因分型可以随时进行，并且可以提供比表型更全面的细节。但是基因分型成本昂贵，还需要大约1星期的周转时间[35]。不同人群可以根据抗原频率及免疫原性的特点选择相应抗原进行分型。根据我国临床血液标本中查出的意外抗体的分布及特点，可对Rh、MNS、Kidd、Lewis、Duffy等血型系统进行分型。

4.3 利用CD38抗原阴性红细胞进行检测：缺乏CD38抗原的红细胞不与单克隆抗-CD38抗体结合，因此在IAT实验中不出现干扰。脐带血红细胞表面缺少或微量表达CD38抗原。据报道利用脐带血红细胞对两名使用达雷妥尤治疗的患者成功地进行了17次抗体筛查及红细胞输注[36]。值得注意的是，脐带血红细胞表面某些抗原可能发生了改变，而且无法保证脐带血红细胞得到充足供应，很难用于常规实验中[33,36-37]。同样，CD38抗原也不表达于Lu（a-b-）红细胞表面，但此细胞非常罕见，而且使用达雷妥尤治疗的患者与此类红细胞交叉配血时可能产生患者血液中含有Lutheran系统相关抗体的假象[38，39]。

4.4 二硫苏糖醇（DTT）预处理供者红细胞：DTT是一种巯基还原剂，它可以通过破坏红细胞胞外区的二硫键进而使红细胞表面CD38变性，达到阻止抗-CD38抗体与红细胞结合的目的[40]。目前国外实验室使用此法的最为普遍。经证实，使用0.2 mol/L DTT预处理的供者红细胞与患者血浆进行IAT试验，不会产生泛凝集的干扰[40]。Hugan等[41]报道，经0.2 mol/L DTT处理的谱细胞在12天内，虽然会发生溶血现象但不影响检测性能，但溶血可能导致DTT处理的谱细胞数量减少。而Lally等[42]研究发现，经DTT处理（未详细介绍DTT处理方法）的筛选细胞在9天内，可检测到细胞表面具有临床意义的抗原（Kell除外），但对于某些同种抗体，反应强度却降低了一到两个等级。

Hosokaw等[43]尝试使用0.01 mol/L DTT处理红细胞，这样既使CD38抗原变性，消除了抗-CD38抗体带来的干扰，又可以部分保留K抗原。Lorenzen等[44]对DTT处理方法又进行了改良，按照红细胞与0.2M DTT体积比为30∶25的比例处理红细胞，经处理的红细胞与未经处理的红细胞有相同程度的溶血现象，而且可以保存33天，此期间内，反应强度没有下降。

尽管DTT预处理供者红细胞的方法从试剂配制到实验结束可能需要花费2～4小时，而且DTT是有刺激性气味的有害物质，部分试验应该在通风柜下操作[5]。经处理过的红细胞表面部分抗原遭到破坏，而且在后续IAT试验过程中容易发生溶血现象。其他和DTT有相似作用的巯基试剂：2-巯基乙醇（2-ME）和溴化2-氨基乙基异硫脲（AET）或许也可以用来去除泛凝集的干扰[40]。

4.5 蛋白酶预处理供者红细胞：人们对于胰蛋白酶或木瓜蛋白酶预处理供者红细胞方面的研究还没有达到研究DTT法的程度，这些方法目前还不太可能取代DTT法。Chapuy等[6]证明2%的胰蛋白酶可将达雷妥尤与CD38阳性的HL-60细胞的结合率降低40%，而使用10 mmol/L DTT则可使结合率降低92%。胰蛋白酶不会降解Kell抗原，但会破坏许多其他具有临床意义的抗原，包括M、N、EnaTS和免疫原性较弱的Ge2、Ge3、Ge4、Ch/Rg、Lutheran等抗原[45]。而Bub等[46]发现，在33名使用了达雷妥尤或Isatuximab单抗治疗的患者中，木瓜蛋白酶处理红细胞可以成功消除单克隆抗-CD38抗体对IAT实验带来的干扰，且能够鉴定出3名患者携带的同种抗体。但是木瓜蛋白酶能降解Duffy和MNS血型系统中的抗原，以及Ch/Rg、Ge2和Ge4等抗原[45]。

4.6 F（ab'）2片段封闭供者红细胞表面CD38抗原：Selleng等[47]利用胃蛋白酶消化达雷妥尤单抗，产生的F（ab'）2片段结合红细胞上的CD38抗原使其被封闭，进而防止达雷妥尤单抗结合红细胞表面CD38抗原从而消除IAT试验的干扰。此法可以检测血清中已经存在的所有同种抗体。

4.7 阻断达雷妥尤单抗法：Chinoca Ziza等[48]首先利用注射后空瓶中残留的达雷妥尤封闭供者红细胞表面CD38抗原，然后再用抗人球蛋白试剂封闭达雷妥尤Fc部分。此时供者红细胞无暴露的CD38抗原以及未经封闭的达雷妥尤Fc部分，且其他抗原不受影响。再将患者血浆与处理好的供者红细胞进行IAT交叉配血时，可避免达雷妥尤单抗造成的干扰。

4.8 IAT试验前使用抗独特型抗体或可溶性CD38受体中和达雷妥尤单抗：防止达雷妥尤对IAT试验产生泛凝集干扰的最直接的方法是在进行IAT试验之前中和患者血清中的达雷妥尤。这可以通过抗达雷妥尤或可溶性CD38受体来实现。理论上，可溶性CD38可以中和任何抗-CD38，而不同的抗独特型抗体只能中和对应的抗-CD38抗体。两项研究分别证实上述两种方法均能消除达雷妥尤的干扰，而且对血清中已经存在的同种抗体不产生干扰，但可溶性CD38受体消除达雷妥尤干扰的效果稍逊于抗独特型抗体法[6,7]。这些方法成本过于昂贵，难以普遍用于常规检测中。

4.9 其他方法：上述解决单克隆抗-CD38抗体对IAT干扰的方法的优点和缺点见表2。除此之外，Chapuy等[6]还尝试通过使用普通红细胞和经ZZAP处理过的红细胞来吸收患者血浆中达雷妥尤以达到消除干扰的目的，但都未能成功。其他抗-CD38抗体也会干扰IAT试验，也可用类似的缓解策略解决[49]。值得注意的是，使用达雷妥尤治疗的患者自身红细胞的反应性经常是阴性的，直接抗球蛋白试验也是如此。这可能是因为患者红细胞表面的部分CD38抗原在循环过程中被清除和/或受到抗-CD38介导影响，CD38抗原表达量下调[50]。这可能解释了为什么达雷妥尤仅在体内引起少量的血红蛋白降低（约1 g/dL），未观察到严重的溶血现象[7，51]。

表2 现有缓解抗-CD38抗体干扰方法的优点、缺点汇总

5 输血管理的建议 随着达雷妥尤等单克隆抗体治疗的日益普及，医务人员需要意识到其对输血前的检测会造成干扰，并制定适当的解决方案以应对。改善临床护理团队与输血实验室之间的沟通至关重要。如果输血实验室操作人员没有意识到患者正在接受达雷妥尤单抗治疗，就会进行冗长繁琐的常规检测，从而浪费了试剂和人力资源，并延迟了交叉配血的时间。高效的患者护理和及时的血液制品交付是每位参与的医务人员共同目标。获知患者将进行单抗治疗前，应该对患者进行ABO/RhD血型鉴定、直抗、抗体筛查等基础试验，有条件的科室可以考虑进行红细胞表型或者基因分型。当患者已经接受了抗-CD38抗体治疗，我们可以首选凝聚胺法进行交叉配血或抗体筛查试验，因为此法简单、省时且试剂廉价，不破坏红细胞表面抗原，而且几乎可以忽略抗-K的问题。其次可以采用DTT等含巯基试剂处理红细胞的方法。理论上，应该给患者提供一张可随身携带的卡片或手环，提示患者正在接受抗-CD38抗体治疗及进行过的基础试验结果，并告知抗-CD38抗体治疗可能会对输血前试验产生干扰，同时还应提供临床医生或医院输血科联系方式，这使得患者旅行或远离治疗医院时遇见紧急情况，医护人员可及时获取有用信息[5]。若进行抢救，来不及交叉配血时，可根据当地血库惯例给予未经交叉配血的ABO、RhD相合的红细胞。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突