女性供者特征对粒细胞集落刺激因子动员的骨髓和外周血混合采集物中造血和免疫细胞组份的影响

尚博菲，孙于谦，王欣玉，常英军，刘艳荣，王 昱，黄晓军，赵晓甦

(北京大学人民医院， 北京大学血液病研究所， 血液系统疾病国家临床医学研究中心，造血干细胞移植治疗血液病北京市重点实验室, 北京 100044)

异基因造血干细胞移植(allogeneic stem cell transplantation, Allo-SCT)是治愈白血病有效乃至唯一的手段[1]。造血和免疫重建是移植成功的关键环节之一，移植物中的造血和免疫组份与移植后的造血和免疫重建密切相关，获取足够数量的移植物组份是保证造血和免疫重建的前提[2-6]。研究显示移植物中低数量的CD34+细胞是导致非体外去除T细胞的单倍型相合移植后血小板植入延迟的独立影响因素[4]。Reshef等[6]报道供者CD8+T细胞数量越高，患者接受减低剂量预处理的Allo-SCT后的总体生存率越好。现有资料表明包括年龄、外周血循环中的单核细胞数量等在内的供者特征是影响移植物组份的重要因素[7-11]；然而，此前的研究主要以总体供者人群和儿童供者为研究对象[4, 7, 9-10]，未见单独分析女性供者对骨髓和外周血混合移植物组份影响的研究报道。本文回顾性分析了111例健康女性供者特征对粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)动员的外周血和骨髓混合移植物中CD34+细胞和免疫细胞亚群的影响。

1 资料与方法

1.1研究对象 纳入2014年4月至2017年10月在我院接受G-CSF动员的111名亲缘健康女性供者，中位年龄32(3～7)岁，中位体重55(5～25) kg，这些供者都给予G-CSF 5 μ/(kg·d)皮下注射，连续4～5天，第4、5天按照我院常规分别采集骨髓和外周血采集物回输给患者；同时留取骨髓和外周血采集物各5 ml，取0.5～1 ml 标本6 h内进行活细胞免疫荧光标记。

1.2主要试剂 鼠抗人单克隆抗体包括异硫氰酸荧光素(FITC)标记的CD45、CD8，藻红蛋白(PE)标记的CD3、CD34，多甲藻叶绿素蛋白(PerCP)标记的CD4、CD45，别藻蓝蛋白(APC)标记的CD3以及APC-H7标记的CD14，上述抗体均购自BD公司。

1.3流式细胞术检测 CD34+细胞和免疫细胞亚群采用多参数流式细胞仪进行检测，抗体组合：管1包括CD45-FITC、IgG同型对照；管2包括CD45-FITC、CD34-PE；管3包括CD8-FITC、CD3-PE、CD45-PerCP、CD4-APC、CD14-APC-H7。取适量的骨髓和外周血采集物分别加入管1～3中，常温避光孵育15 min；加入溶血素2 ml室温避光10 min, 溶解红细胞。然后1 200 rpm/min离心5 min, 弃上清，用PBS将标记细胞洗涤1次，弃上清，加入150 μl PBS上机检测。应用BD FACS DIVA 软件(BD公司的FACS CANTO-Ⅱ型流式细胞仪)分析。采用ISHAGE设门法分析CD34测定管。

1.4统计学方法 应用SPSS 19统计软件进行分析，组间比较采用χ2检验分析，采用Logistic回归进行多因素分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1供者临床及骨髓和外周血混合采集物特征 入组的111例健康供者中无孕史的35例，有孕史的76例，其中怀孕1次、2次、3次和4次的分别是34例、30例、9例和3例。其他供者特征，包括年龄、身高、体重以及不同时间点的血常规值包括白细胞(WBC)、淋巴细胞(LYM)、单核细胞(MONO)、血红蛋白(HB)和血小板(PLT)等，见表1。

所有供者分别采集1 000 ml骨髓和循环10 000 ml外周血；111例健康女性供者骨髓和外周血混合采集物中所含CD34+细胞、CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞、CD3+CD4-CD8-T细胞和单核细胞数量以供者每公斤体重计算，分别为2.39(0.61～10.33)×106、226.57(96.68～519.96)×106、120.80(47.43～256.08)×106、89.99(22.89～274.24)×106、15.05(2.72～86.13)×106和149.84(30.04～353.79)×106。

2.2111名健康女性供者特征对骨髓和外周血混合采集物组份的影响 以骨髓和外周血混合采集物中的CD34+细胞、CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞、CD3+CD4-CD8-调节性T细胞和单核细胞的数量为因变量，以怀孕次数、年龄、身高、体重、体表面积、BMI、稳态(WBC、LYM、MONO、HB、PLT)、骨髓采集当日(WBC、LYM、MONO、HB、PLT)、外周采集当日(WBC、LYM、MONO、HB、PLT)为自变量。进行多因素Logistic回归分析，结果显示BMI、骨髓采集日LYM、外周采集日LYM对CD3+T细胞有影响。外周采集日LYM对CD3+CD4+T细胞有影响。怀孕次数为0、外周采集日LYM、外周采集日PLT对CD3+CD8+T细胞有影响。年龄、BMI骨髓采集日LYM、外周采集日WBC对CD3+CD4-CD8-T细胞有影响。供者特征对骨髓和外周血混合采集物中CD34+细胞的数量无影响。见表2、3。

表2.1 因变量赋值表

表2.2 自变量赋值表

表3 111名健康女性供者特征对骨髓和外周血混合采集物组份影响的多因素分析

3 讨 论

本研究发现，与怀孕2次以上的女性相比，未怀孕女性供者骨髓和外周血混合采集物含有更高数量的CD3+CD8+T细胞；与BMI>21.77的患者相比，BMI≤21.77的供者获得混合采集物含有的CD3+T细胞和CD3+CD4-CD8-T细胞的数量更多；供者外周血采集当日的LYM>3.15×109/L的女性供者混合采集物中含有数量更多的CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞、CD3+CD4-CD8-T细胞的数量较多；年龄≤32的供者较大于32岁供者的混合采集物中的含有的CD3+CD4-CD8-T细胞数量较多；该研究从女性供者特征对移植物组份影响的角度为最佳供者选择提供了新的证据[2-6]。

我们以前的研究发现年龄是影响骨髓采集物和外周干采集物中CD34+数量的主要因素[7, 9-10]；与这些研究不同[7, 9-10]，本研究并未发现供者年龄是采集物中CD34+细胞的影响因素；上述差异的原因可能与本研究与此前研究入组的人群不同[7, 9-10]，此前的研究入组的是整体健康供者人群，即包括健康儿童、成人，也包括男性和女性[7, 9-10]，而本研究入组的仅仅是健康女性供者。21项女性供者特征均对CD34+细胞数量无影响。分析其可能原因为这4项女性供者特性受到其他17项供者特征的影响。

Wang等[9]发现健康供者总体人群中，外周血干细胞采集当天的LYM数量对骨髓和外周血混合采集物中CD3+T细胞和CD3+CD4+T细胞的数量有影响。本研究发现外周血采集当天的LYM数量不仅对CD3+T细胞有影响，而且还对CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞有影响。Cao等[10]以儿童健康供者为研究对象，结果发现骨髓采集当天的LYM数量对CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞有影响。而本研究发现骨髓采集当天的LYM数量对CD3+T细胞和CD3+CD4-CD8-T细胞有影响。由于以前的研究[7, 9-10]和本研究中G-CSF的用量和疗程相同，人群差异可能是3组健康供者骨髓和外周血混合采集物中T细胞亚群影响因素有差异的根本原因。与此前的研究一致[10]，本研究发现低BMI的女性供者更易采集到的富含CD3+T细胞的骨髓和外周血混合移植物。总之，根据供者外周血采集前的LYM数量、BMI或选择未怀孕的供者，有助于采集到含高数量CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞或CD3+CD8+T细胞的移植物，进而改善移植预后[6, 12-13]。

本研究还发现年轻、BMI以及骨髓采集当天的LYM数量对采集物中CD3+CD4-CD8-T细胞数量有影响。在总体健康供者人群，年轻和供者体重是骨髓和外周血采集物中CD3+CD4-CD8-T细胞数量的影响因素[9]。儿童健康供者人群中，BMI和应用G-CSF前外周血的LYM数量是骨髓和外周血采集物中CD3+CD4-CD8-T细胞数量的影响因素[10]。此前研究和本研究中骨髓和外周血采集物中CD3+CD4-CD8-T细胞数量影响因素的差别主要归因于不同研究之间健康供者人群特征的差别[9-10]；这也为在不同供者人群中依据各自的特征选择合适的供者以获取含高数量的CD3+CD4-CD8-T细胞的移植物提供了可能，上述移植物回输有助于降低移植后急性移植物抗宿主病的发生率[14]。

总之，本研究以健康女性供者为研究对象，从年龄、BMI、外周血LYM等供者特征角度提供了影响骨髓和外周血混合移植物中造血细胞和免疫细胞含量的详细参数，有助于女性最佳供者的选择[15]。鉴于本研究为回顾性、单中心研究，今后应该开展多中心、前瞻性研究来证实上述结果。