多中心HBV、HCV、HIV血清学检测弱反应性标本的核酸检测结果分析*

董航 黄雪原 贺理 黄丽芳 邓中平 王海燕 王勇军 王顺 凌锋

2019年国家卫生计生委疾病预防控制局的统计数据表明，全国乙型病毒性肝炎发病100.2万例，丙型病毒性肝炎发病22.4万例和艾滋病发病7.1万例[1]。这些传染性疾病为患者和国家带来沉重的经济负担。临床上，对传染性病原体进行早期筛查有利于相关疾病的早期诊断与治疗，以防止病原体对机体的进一步侵害。目前，国内外主要通过血清学检测和病毒核酸检测来辅助诊断病原体感染。

血清学检测方法主要包括ELISA、胶体金和化学发光法。其中化学发光与前两种方法相比具有灵敏度高、能定量分析等优点。它能更好地检出位于窗口期和隐性感染的人群，对临床输血、流行病学研究、动态观察病情和治疗具有非常重要的意义[2]。但是随着化学发光法灵敏度的增高，特异性降低，因而可能会导致很多假阳性结果。检测下限的降低，使一些弱反应性标本在定性的判读上难以把握，从而给临床的分析和解释工作带来了不便。

血清学检测结果的判读是根据被测物的吸光度（S）同临界值（CO）的比值（S/CO）来决定，一般S/CO＞1判定为反应阳性；S/CO＜1则判定为阴性。而弱反应性是指处于阳性S/CO判定值附近，临床意义为可疑标本[3]。临床检验人员在实际工作中发现，检测结果呈弱反应性的标本检测重复性差，对这些结果的报告和处理一直困扰着临床检验人员。同时，由于各生产厂家检测试剂存在材料、技术的差异，导致检测结果也存在差异。目前国内各医疗及检验机构对弱反应性范围设定未达成一致，各实验室根据自身检测结果设置合理“灰区”，对弱反应性结果应进行复检或采用其他检测方法以确定最终检验结果，以减少假阳性标本的误诊率和假阴性标本的漏诊率。

本研究旨在对HBV、HCV、HIV血清学检测结果呈弱反应性的标本进行核酸检测复核，分析核酸检测对血清学弱反应性标本结果判断的指导性意义。

对象与方法

1 研究对象 在参加多中心研究的单位中，有5家医疗机构提供HBV、HCV、HIV血清学检测的“灰区范围”。连续收集2019年10月1日～2020年6月30日期间5家医疗机构进行输血前感染性疾病筛查/术前感染性疾病筛查患者的血清或血浆标本共5 782例。本研究已在ClinicalTrials.gov注册（注册号为NCT04471688）。并获得了中南大学湘雅三医院医学伦理委员会批准（批件号为2019-S483）。

2 试剂与仪器 全自动化学发光免疫分析仪及其配套抗体试剂盒 （A试剂、B试剂、C试剂）， 全自动核酸提取仪，核酸检测扩增仪，乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（1+2）三联核酸检测试剂盒（圣湘生物科技股份有限公司）。

3 方法 所有检测和结果判断均严格按仪器及试剂操作说明进行。收集的血清或血浆标本均进行化学发光免疫分析检测，各实验室通过大量样本筛查确认实验及数据分析确认“灰区”范围，对弱反应性结果标本进行核酸检测。在本研究的核酸检测中，HBV核酸检测循环阈值（Cycle threshold，Ct值）≤45为阳性，最低检测限为3 IU/mL；HCV核酸检测Ct≤45为阳性，最低检测限为10 IU/mL；本研究HIV核酸检测Ct≤45为阳性，最低检测限为45 IU/mL。

结 果

1 不同医疗机构化学发光法检测感染性疾病的阳性检出值及“灰区”范围 本研究在5家医疗机构共收集并检测5 782例标本，其中53例乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、艾滋病毒（HIV）血清学检测结果呈弱反应性。表1所示，各医院使用化学发光试剂种类及各自的阳性检出值及“灰区”范围存在一定差异。

表1 五家医疗机构化学发光法检测感染性疾病的阳性判定标准及“灰区”范围

2 HBV血清学弱反应性标本的核酸检测结果 本研究共有HBV血清学弱反应性标本24例，均大于阳性检出值0.05 IU/mL，其中15例结果为HBV核酸反应阳性，另外9例结果为HBV核酸反应阴性（表2）。

3 HCV血清学弱反应性标本的核酸检测结果 在本研究中，HCV血清学弱反应性标本25例，22例大于阳性检出值1 S/CO，25例均为HCV核酸检测反应阴性（表3）。

4 HIV血清学弱反应性标本的核酸检测结果 本研究中HIV血清学弱反应性标本共4例，对这4例进行核酸检测，结果均呈阴性（表4）。

讨 论

近年来,化学发光检测技术广泛应用,是临床上进行感染性疾病筛查的重要检测手段。但化学发光检测病毒抗原或抗体的假阳性问题一直比较突出。标本出现弱反应性结果的原因有许多因素[4，5]：①HBV、HCV、HIV病毒处于感染早期即窗口期，或处于恢复末期，体内虽有病毒复制，但病毒载量较低；②病毒基因变异；③钩状效应；④试剂因素；⑤人为因素；⑥标本不合格，都有可能对检测结果造成影响。在本研究中，我们对血清学检测结果出现弱反应性的标本进行病毒核酸检测。

HBV可引起急性和慢性乙肝、肝硬化和肝细胞癌[6]。目前，经血液传播的HBV风险明显高于HCV和HIV，一般证明HBV感染是检测患者体内HBsAg和HBc抗体，或通过核酸检测HBV DNA。一般在HBV病毒感染后30～60天可以检测到HBsAg，但若是急性感染，在检测HBsAg前几周内，患者病情发展为病毒血症，病毒载量达到109～1010个/mL[7]。再通过抗病毒治疗，患者血液中HBsAg消失或滴度降低，使用血清学试剂无法检测。基于提高灵敏度和缩短窗口期的目的，HBV核酸检测被用于感染性疾病筛查。统计学理论认为弱反应性标本发生误判、漏检的概率约为50%[3]，各实验室根据自身条件设置“灰区”，正是为了减少或避免上述这种弱反应性标本结果误诊和漏检现象的发生。在本研究中，血清学弱反应性标本的核酸反应阳性率为62.5%，这在一定程度上证明化学发光法的灵敏度较高，同时也证明核酸的二次检测能减少标本结果报告假阳性的发生率。核酸检测方法是目前血液HBV筛查已经较成熟的检测方法, 可检测出血液中较低水平的HBV病毒载量, 且能检测出HBV病毒的隐匿性感染、病毒亚型和病毒变异。

表2 HBV血清学弱反应性标本的核酸检测情况

表3 HCV血清学弱反应性标本的核酸检测情况

表4 HIV血清学弱反应性标本的核酸检测情况

关于HCV检测，在本研究中，弱反应性标本的核酸阳性率为0。一方面原因是三个医疗机构均使用A公司的抗原抗体试剂盒，该试剂盒灵敏度较高，假阳性率也随之升高，已有文献结果表明使用A公司弱反应性标本假阳性率达到92%[8]，这与本研究结果相近。由于HCV在全球范围内广泛流行，全球流行率约为3.0%[9]。在我国，在14 218 000名献血者中，有40 000人筛查HCV抗体反应性，其流行率约为0.28%[10]。同时有研究报道，在筛查HCV抗体反应性的献血者中，真正HCV确证阳性率约为10.9%[11]，这证明高灵敏度的血清学筛查在降低传播HCV风险的同时，也增加了较多的假阳性结果。同时假阳性结果也会引起患者不必要的焦虑，进而引发一些社会问题。如果对血清学筛查弱反应性患者进行核酸检测，或许是解决该问题很好的途径。另一方面则可能是标本质量及每个患者自身血清特异性。目前，国内外学者对造成抗HCV抗体筛查假阳性的具体原因并未完全清楚，高浓度的非特异性IgG、类风湿因子、补体、自身抗体、标本溶血、标本被细菌污染等因素均可能引起假阳性的检测结果[12-14]，这些导致假阳性的因素还需进一步深入研究。

在本研究中4例HIV血清学弱反应性标本的核酸阳性率为0。分析原因如下：目前我国HIV人群感染率为万分之九[1]，处于低流行水平；血液筛查重点在于灵敏度，目的在于尽可能降低血液传播感染性疾病的风险，众所周知，在实验原理和技术水平相同的条件下，试剂的灵敏度越高，特异性越差，灵敏度较高的化学发光检测可能会导致很多的假阳性问题。特别是当COI＜10或S/CO＜1时，其假阳性率更高[15]。因此国内血站普遍采用两种血清学检查加核酸检测方式对HIV感染进行确认[16]。

综上所述，核酸检测相比血清学检测，特异性更高，能直接检测患者体内的病原体。因此我们推荐检测人员在面对血清学弱反应性标本时，宜进行双孔复检，若均为阴性结果则报告阴性结果。若仍有反应性（一孔或两孔），宜进行HBV、HCV、HIV（1+2）核酸检测，临床医师宜结合接触史、核酸检测结果和其他检验结果（如肝功能）来诊断和监测治疗效果，必要时4周后重新采样检测，观察血清学和核酸指标的变化情况。此外，本研究还存在以下不足之处：首先研究人群主要集中于南方地区，未包括北方地区的术前/输血前患者；其次本研究五家医疗中心根据各中心检测结果设置“灰区”，其界定的“低值阳性”标准不一，可能存在一定偏倚。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突