藤黄健骨胶囊对膝骨关节炎大鼠血细胞变化及炎症因子表达的影响

颜春鲁， 安方玉， 蒋国凤， 赵崇博， 李嘉进， 李孟翰， 郭 丹

(1. 甘肃中医药大学 中西医结合学院， 兰州 730000； 2. 甘肃中医药大学 教学实验实训中心， 兰州 730000；3. 甘肃中医药大学 临床医学院，兰州730000； 4. 甘肃中医药大学 中医临床学院， 兰州 730000)

现代医学认为，膝骨关节炎(Knee osteoarthritis，KOA)是一种涉及膝关节软骨、软骨下骨并形成关节软骨骨赘的慢性退行性关节病变，已成为老年人致残最常见的关节退变性疾病[1]，其发病机制尚未完全明确。目前认为，KOA发病的根本原因是各种致病因素造成软骨细胞的破坏和细胞外基质的合成与降解失衡。近年研究[2-4]也表明，炎性因子引发的关节腔内炎症反应是导致KOA关节发生退变的另一重要因素，也是导致KOA患者出现关节疼痛的主要诱因，这些细胞因子主要包括白细胞介素(Interleukin，IL)、趋化因子(Chemotactic factor，CC)以及肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)等。白细胞介素-6(Interleukin，IL-6)是一种与多种炎症介质具有协同作用的促炎因子，是调节关节软骨炎症反应的始动因素[5]。如：骨关节炎模型鼠关节腔内白细胞介素-1(Interleukin，IL-1)、IL-6及肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)表达水平的增加程度与炎症严重程度存在正相关关系，可以作为骨关节炎疾病程度的参考指标[6]；IL-6和IL-1β还是造成KOA关节软骨破坏和软骨基质降解最主要的细胞因子[7]。IL-2是一类由Th1细胞分泌的细胞因子，过量分泌可引起局部慢性炎症[8]，还可以刺激软骨细胞分泌金属蛋白酶，破坏或者抑制基质合成，引起单核巨噬细胞炎性浸润，导致软骨组织破坏，引起疾病发生[9]。研究结果表明，膝关节滑膜液内的细胞因子是KOA发生疼痛的主要原因[2]。

疼痛既是KOA最常见的临床症状，也是大多数患者就诊的主要原因。藤黄健骨胶囊具有补肾、活血、止痛等功效，临床主要用于治疗增生性关节炎和大骨节病等。有研究[10-11]发现，藤黄健骨胶囊主要通过调控骨质疏松模型鼠的钙磷代谢和OPG/RANK/RANKL调节轴来影响其骨密度和骨矿含量，实现其治疗作用。藤黄健骨胶囊是否对KOA治疗有效及其治疗机制是什么，目前鲜见报道。因此，本研究采用改良后Hulth 法建立KOA大鼠模型，通过观察藤黄健骨胶囊对KOA大鼠模型血细胞变化和炎症因子变化的影响，初步探讨藤黄健骨胶囊的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

60只SPF级SD雌性大鼠，体重(200±20)g，由甘肃中医药大学科研实验动物中心提供。实验动物质量合格证编号：SCXK(甘)2011-0001。

1.2 试剂及实验药物

水合氯醛(天津市光复精细化工研究所，批号：20150105)；庆大霉素(辰欣药业股份有限公司，批号：1805312221)；Rat IL-2 ELISA Kit检测试剂盒(江苏菲亚生物科技有限公司，批号：MM-0192R1)；Rat IL-6 ELISA Kit检测试剂盒(江苏菲亚生物科技有限公司，批号：MM-0190R1)；藤黄健骨胶囊(甘肃省西峰制药有限责任公司，规格0.25 g/粒，批号：503010)；仙灵骨葆胶囊(国药集团同济堂(贵州)制药有限公司，规格0.5 g/粒，批号：190111)。

1.3 主要仪器

iMark型自动酶标分析仪(美国Bio-Rad公司)；FA2004N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；TDZ5-WS型医用离心机(湖南平凡科技有限公司)；SYSMEX型全血自动分析仪(上海玉研科学仪器有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 实验药物给药剂量

藤黄健骨胶囊，人的临床用量为：2 g/d，按照人与大鼠的体表面积换算法2 g×0.018×5=0.18 g/kg作为中剂量，则藤黄健骨胶囊高、中、低剂量分别为0.36、0.18和0.09 g/kg。阳性对照药仙灵骨葆胶囊，人的临床用量为3 g/d，按照人与大鼠的体表面积换算法3 g×0.018×5=0.27 g/kg。

1.4.2 动物分组、造模及给药

将 60 只 SD大鼠随机分为假手术组、KOA模型组、阳性对照组(仙灵骨葆胶囊)以及藤黄健骨胶囊高、中、低剂量组，每组10只。除假手术组外，其余各组大鼠用改良Hulth 法[12-13]造模，采用10%质量分数的水合氯醛腹腔注射麻醉各组动物后，将其仰卧位固定于操作台，作髌骨前长约3 cm的内侧切口，逐层分离显露髌骨，切除前交叉韧带和内侧半月板，行抽屉试验阳性后逐层缝合切口。假手术组只作髌骨前长约3 cm的内侧切口，逐层分离暴露关节腔，对前交叉韧带、内侧副韧带和半月板均不作切除处理。术后3 d 各组大鼠给予庆大霉素以防感染。造模6周后假手术组、模型组大鼠给予等体积生理盐水灌胃方式，阳性对照组给予仙灵骨葆胶囊(0.27 g/kg)灌胃，藤黄健骨胶囊干预组给予高、中、低剂量的藤黄健骨胶囊(0.36、0.18和0.09 g/kg)灌胃治疗，1次/d，连续干预8周。

1.4.3 HE染色观察骨形态学变化

动物处死后取完整膝关节，将各组动物的右侧膝关节脱钙处理4周后，进行常规石蜡包埋，切约5μm厚度的切片，HE 染色，倒置在显微镜下观察各组大鼠软骨组织的形态学变化并进行 Mankin 评分，具体评分依据参考文献[14]。

1.4.4 足跖肿胀厚度的测定

用游标卡尺分别测量各组大鼠造模前和干预后的右后足足跖厚度，用公式计算足跖肿胀度[15]。足跖肿胀度(mm)= 干预后足跖厚度(mm)-造模前足跖厚度(mm)。

1.4.5 外周血细胞变化的测定

末次给药24 h后，腹腔注射10%质量分数水合氯醛麻醉各组动物，摘除各组动物的眼球，取血用全血自动分析仪测定各组大鼠白细胞(White blood cell，WBC)、中性粒细胞(Neutrophils，N)、淋巴细胞(Lymphocyte，L)、单核细胞(Monocyte，M)和嗜酸粒细胞(Eosinophils，EOS)水平。

1.4.6 血清IL-2和IL-6含量的测定

眼球采血，血标本静置2～3 h，1500 r/min离心10 min分离血清。ELISA法检测各组动物血清IL-2及IL-6含量等指标。具体操作按试剂盒说明书进行。

1.4.7 数据分析

2 结果与分析

2.1 对软骨组织病理形态改变的影响

软骨组织病理形态结果显示：假手术组大鼠关节面及滑膜结构完整，软骨细胞呈水平排列，关节软骨边缘光滑；KOA模型组大鼠关节面严重受损，软骨细胞大量脱落；藤黄健骨胶囊低剂量组大鼠关节关节面受损比较严重，软骨细胞排列紊乱；藤黄健骨胶囊中、高剂量组和阳性对照组大鼠关节面及滑膜结构趋于正常，软骨细胞排列整齐，并呈水平排列。Mankin评分结果显示：与假手术组比较，KOA模型组大鼠Mankin评分升高，有显著性差异(P<0.05)；与KOA模型组比较，藤黄健骨胶囊中、高剂量组和阳性对照组大鼠Mankin评分均降低，有显著性差异(P<0.05)。具体见图1和表1。

(a)假手术组；(b)KOA模型组；(c)阳性对照组；(d)藤黄健骨胶囊高剂量组；(e)藤黄健骨胶囊中剂量组；(f)藤黄健骨胶囊低剂量组

表1 藤黄健骨胶囊对去KOA模型大鼠Makin评分的影响(±S，n=10)

2.2 对足跖肿胀的影响

与假手术组比较，KOA模型组右后足足跖肿胀显著增强(P<0.05)；与KOA模型组比较，藤黄健骨胶囊各剂量组和阳性对照组大鼠右后足足跖肿胀显著减轻(P<0.05)。具体见表2。

表2 藤黄健骨胶囊对KOA模型大鼠足跖肿胀的影响

2.3 对血细胞变化的影响

由表3可知：与假手术组比较，KOA模型组大鼠白细胞(White blood cell，WBC) 、中性粒细胞(Neutrophils，N)、中性粒细胞/淋巴细胞(Neutrophils/lymphocyte，N/ L)等指标均升高，淋巴细胞(Lymphocyte，L)的数目降低(P<0.05)；与假手术组比较，KOA模型组大鼠单核细胞(Monocyte，M)和嗜酸粒细胞(Eosinophils，EOS)的含量也减低，但无显著性差异(P>0.05)；与KOA模型组比较，藤黄健骨胶囊中、高剂量组和阳性对照组N的数目明显降低，L的数目明显增加，藤黄健骨胶囊各干预组和阳性对照组的WBC和 N/L等指标均明显降低(P<0.05)；与KOA模型组比较，藤黄健骨胶囊各剂量组和阳性对照组大鼠M和EOS的含量升高，但无显著性差异(P>0.05)。

2.4 对IL-2和IL-6含量的影响

由表4可知：与假手术组比较，KOA模型组大鼠IL-2含量和IL-6含量显著升高(P<0.05)；与KOA模型组比较，藤黄健骨胶囊高剂量组和阳性对照组IL-2含量显著降低，藤黄健骨胶囊各干预组和阳性对照组IL-6含量均显著降低(P<0.05)。

3 讨论与结论

中医将KOA归属于“筋痹、骨痹”范畴[16]。中医理论认为，膝关节的局部湿浊痹阻与气滞血瘀是导致KOA的主要病机，而长期的湿浊痹阻与气滞血瘀又会导致筋脉受阻、肾气亏损、经络受到淤滞，故临床治疗中以补肾壮骨、利湿除痹、舒筋通络、活血化瘀和行气止痛为主。藤黄健骨胶囊组方：熟地黄具有补血滋阴、益精填髓的功效，为君药；鹿衔草、骨碎补(烫)、肉苁蓉、淫羊藿辅助君药发挥补益肝肾、强筋健骨的功效，为臣药；鸡血藤具有补血、活血、通络等功效，为佐药；莱菔子具有消食除胀、降气化痰的功效，为使药。可见，藤黄健骨胶囊的组方原则与KOA的中医病机是相吻合的。并已有研究[17-18]证明，藤黄健骨胶囊治疗KOA有效。

表3 藤黄健骨胶囊对膝骨关节炎模型大鼠血常规的影响

表4 藤黄健骨胶囊对KOA模型大鼠IL-2和IL-6含量的影响

在KOA的发生发展过程中，膝关节会因各种原因造成关节滑膜的损伤，导致滑膜下层毛细血管的通透性上升，从而使大量的渗出液积聚在关节腔内，从而引起关节肿胀、疼痛等，引发关节炎症反应。研究[19-20]发现，在KOA模型大鼠中，促炎因子IL-1和IL-6可以促进关节炎症细胞的浸润，而大量炎症细胞的浸润反过来进一步促进了关节腔内液体的渗出，加重了关节软骨组织的病理损伤、关节软骨的破坏和退变，从而造成恶性循环。KOA模型组大鼠关节面严重受损，软骨细胞大量脱落，Mankin评分升高和右后足足跖肿胀显著增强，炎症细胞WBC数目和N数目显著增加，炎症细胞因子IL-2含量和IL-6的含量也显著升高，而藤黄健骨胶囊可以使KOA模型组大鼠的关节面及滑膜结构趋于正常，可以显著降低KOA模型组大鼠的右后足足跖肿胀，显著降低炎症细胞WBC数目和N数目，同时也显著降低其炎症细胞因子IL-2含量和IL-6的含量。这说明藤黄健骨胶囊治疗KOA有效，其具体机制可能是通过减少KOA机体炎症细胞因子的分泌来减轻局部炎症细胞的浸润，减少关节液的渗出，从而改善关节软骨组织的病理损伤，减轻关节软骨的破坏和退变，从而发挥治疗抗炎镇痛的效果。但其具体的分子机制还需要进一步深入研究。