拟南芥铜锌超氧化物歧化酶解聚的中间态性质

刘祚军，黄胜威，李明浩，吴丽芳

(1. 中国科学院 合肥物质科学研究院， 合肥 230031； 2. 中国科学院大学， 北京 100049； 3. 安徽省农业科学院 农业工程研究所， 合肥 230001)

植物在受到外界环境胁迫时产生应激反应，并通过产生活性氧建立防御机制。然而，活性氧的产生是不可控的，过量的活性氧又会引起对植物体蛋白质、脂类、核酸等的损伤[1]。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是一类广泛存在的金属酶，负责清除生物体内有害的活性氧，被认为是衡量植物抗逆性状的一种重要指标蛋白[2-3]。根据活性中心结合金属离子的不同，SOD分为铜锌超氧化物歧化酶(Cu, Zn superoxide dismutase， Cu, Zn-SOD)、铁超氧化物歧化酶(Fe superoxide dismutase，Fe-SOD)、锰超氧化物歧化酶(Mn superoxide dismutase，Mn-SOD)和镍超氧化物歧化酶(Ni superoxide dismutase，Ni-SOD)等4类。其中，在高等植物中，Cu, Zn-SOD在体内含量最高、分布也最为普遍，因此，其相关研究具有重要的理论和农业生产意义[4]。

拟南芥(Arabidopsisthaliana)是重要的模式生物，已发现有7个SOD酶，其中，拟南芥铜锌超氧化物歧化酶(Arabidopsisthalianasuperoxide dismutase 1，AtSOD1)被推测为一个大小为32 ku的同源二聚体，是理想的研究植物SOD酶结构与功能关系的模式蛋白[5-6]。

目前，对AtSOD1的研究仍不够深入，因此其在体内表达调控机制依旧不明[7]。其主要原因有两个方面：一是生物体内条件复杂，导致机理研究困难；二是对于该酶本身的性质，如稳定性、活性特别是结构与活性的关系等基本信息了解不够充分，这在很大程度上限制了相关研究的开展。本研究结合圆二色谱(Circular dichroism，CD)、差示扫描量热法(Differential scanning calorimetry，DSC)、电子顺磁共振波谱(Electron paramagnetic resonance，EPR)等方法对AtSOD1酶的基本性质进行表征，以期为AtSOD1酶结构与功能以及金属配位结构研究提供方法学和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 AtSod1的克隆、表达与蛋白质纯化

采集拟南芥新鲜嫩叶(约40 d) 50～100 mg，按照 Trizol RNAiso Plus 试剂盒说明书提取总RNA，以总RNA为模板，利用Super Script II反转录试剂盒获得cDNA，再以此为模板，根据AtSod1(NCBI 序列号：X60935.1)的序列设计引物(正义引物：5′-GGAATTCCATATGGCGAAAGGAGTTGCAGT-3′；反义引物：5′-CCCAAGCTTTTAGCCCTGGAGACCAATGA-3′)，扩增AtSod1，将扩增片段克隆到pET-28a载体(Novagen)，转化大肠杆菌Rosseta菌株，28 ℃，培养至OD600约0.8时，1 mmol/L IPTG诱导表达6 h后，超声破碎，取上清液，蛋白质经Ni-NTA树脂(Novagen)亲和层析和HiprepTm16/60 SephacrylTmS-200 HR分子筛纯化，透析处理浓缩后用于后续分析。

1.2 AtSOD1的浓度和Km值测定

使用改良型 Bradford 法蛋白浓度测定试剂盒(上海生工，产品编号C503041)进行蛋白浓度的测定。595 nm处测定吸光度值，做标准曲线，计算蛋白质的浓度。具体方案详见产品说明书。

Km测定：酶的浓度不变，通过改变底物自由基的量来测定。Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度。

1.3 AtSOD1的活性中心金属配位表征

利用电子顺磁共振技术测定SOD酶的活性中心Cu的配位结构[8]。样品质量浓度根据SOD酶中的铜离子含量而定，一般不低于0.5 mg/mL即可。样品要在液氦温度20 K测定，X波段，微波功率6.33 mW，微波频率9.39 GHz，磁场调频100 KHz，磁场调幅1～10 Gs(视样品情况而定，通常5 Gs)，扫描时间24 s，扫描次数1～20次(视样品情况而定，通常10次)。

1.4 AtSOD1的化学稳定性分析

利用尿素(Urea)对SOD酶进行化学解叠，以圆二色谱来测定二级结构的变化，分析其化学稳定性。具体方法为，先根据蛋白的浓度，设置一定的梯度，将蛋白的CD初始峰值设置在-30～-20为宜，便于下一步结构解叠时的观察。尿素解叠蛋白反应的总体积为500 μL，SOD酶的浓度恒定，尿素浓度设置合理的梯度(0～8 mol/L)，余下的体积由buffer补平。扫描时，采取较慢的扫描速度和较长的响应时间提高信噪比。

1.5 AtSOD1的物理稳定性分析

利用差示扫描量热仪法测定SOD样品。该方法中，质量浓度要求5 mg/mL以上，温度先升到120 ℃，然后缓慢降到25 ℃，在降温过程中观察比热容值的变化，计算蛋白质处于中间态时的Tm值。

2 结果与分析

2.1 AtSOD1的表达与纯化

经预测分析，AtSOD1经pET-28a载体表达后，氨基酸数目为172个，分子质量约18 ku，等电点为6.05。诱导表达后，经鉴定目标酶蛋白主要在上清液中，因此取上清液用于下一步的亲和层析。亲和层析结果显示，杂蛋白带明显。因此进一步进行分子筛纯化，获得目标酶蛋白(图1)。

2.2 AtSOD1的含量与Km值测定

经测定蛋白质的质量浓度，制定了标准曲线，相应的方程为Y=0.005 73X。

图1 AtSOD1的分子筛纯化结果

通过黄嘌呤氧化酶体系测试了SOD的酶催化动力学，相应的酶的米氏常数为km=0.2 μmol/L，具体见图2。

2.3 AtSOD1的活性中心金属配位表征

Cu, Zn-SOD酶在进化上比较保守，分子中的Cu为二价，具有顺磁性[4]。AtSOD1的低温EPR结果显示，其具有典型的二价铜的特征峰，不过信号比较弱。将蛋白浓缩至10 mg/mL左右时，信号并没有明显的增强，表明AtSOD1中铜离子的含量很低。

图2 AtSOD1的Km值

细胞中的铜离子90%结合到铜蓝蛋白中，极少以游离的一价铜存在[9]。在真核生物中，Cu, Zn-SOD的成熟需要铜转运蛋白(Copper chaperone for superoxide dismutase1，CCS)作为伴侣分子。该蛋白可以通过和SOD酶间的相互作用来传递铜到达它的目的地，并帮助SOD酶正确折叠具备催化活性[10]。

Cu, Zn-SOD在酵母表达时，由于本身具有CCS蛋白，因此很容易表达出折叠正确的活性蛋白[11]。而在大肠杆菌中，由于本身不含CCS蛋白，因此表达出来的SOD酶生物活性往往很低，不过，通过共表达CCS蛋白也可以表达出活性Cu, Zn-SOD[10]。

图3 外源铜锌离子影响活性AtSOD1酶表达的EPR表征

分别通过向培养基中补充终浓度10 μmol/L CuSO4、4 μmol/L Zn (NO3)2和100 μmol/L CuSO4、40 μmol/L Zn (NO3)2两个梯度，诱导表达AtSOD1[4]。提取纯化后，将蛋白质浓度校准为500 μg/mL，进行低温EPR检测，结果(图3)发现，随着外源补充金属离子浓度的增加，EPR信号依次增强，显示正相关性。EPR拟合结果显示，关键参数g值没有发生改变，说明Cu2+正确结合到SOD中。

2.4 AtSOD1的化学稳定性

分别以天然态AtSOD1(holo态)和去除金属离子的AtSOD1(apo态)为研究对象，利用尿素(Urea)对SOD酶进行化学解折叠，然后通过测定其CD结构的变化来对它的稳定性进行表征。结果显示，解折叠态与holo态相比，α-螺旋的比例由13.6% 增至30.9%，β-折叠由43.6%降为0.0%，β-转角由原来的 11.6%增加至37.5%。结果表明，对于AtSOD1来说，β-折叠是维持蛋白质结构稳定性的重要因素[12]。

以往研究[13-14]表明，SOD酶尿素解折叠反应时，与apo态相比，holo态的二级结构对尿素不敏感。本研究表明，利用尿素处理AtSOD1，不论是apo态还是holo态，解折叠曲线均发生了明显的向长波方向的红移现象，即β-折叠比例减少，α-螺旋增加，且在225 nm附近出现了一个拐点(图4)。进一步分析0～8 mol/L尿素处理AtSOD1后225 nm处波长的变化。结果显示，apo态AtSOD1加入一定浓度的尿素后，迅速解折叠，这可能与失去金属离子后AtSOD1的稳定性下降有关[13]。而holo态AtSOD1尿素处理结果显示，在尿素浓度达到4～5 mol/L时，解折叠曲线出现了平台期，这在以往的文献中未见报道(图5)。推测认为该平台期与holo态AtSOD1二聚体解聚为单体的过程有一定的关联。

(a)holo态的解折叠结果；(b)apo态解折叠的结果。二者皆在约225 nm处出现拐点

A：holo态AtSOD1；B：apo态AtSOD1

2.5 AtSOD1的物理稳定性

研究表明，Cu, Zn-SOD酶耐高温，在75 ℃时，构象不发生明显变化，但仍具有酶的催化活性，一般认为与金属离子Cu2+和Zn2+的存在有关[13]。比热容是热力学中常用的一个物理概念，是单位质量物质的热容量，即单位质量物体改变单位温度时吸收或放出的热量，属于物质本身的属性，具有指纹属性。对于蛋白质来说，每一个比热容值对应着相应的相对稳定的构象，Tm值是处在两种状态之间的中间态，Tm值越低，某种程度上意味着稳定性越差[15]。

将AtSOD1加入DSC仪中，迅速升温到120 ℃，然后缓慢降到25 ℃，观察Tm值的变化(图6)。结果显示，对于 holo态AtSOD1来说，存在两个Tm值，分别为102.2 ℃和100.5 ℃，前一个值反映了AtSOD1完全解折叠的状态，另一个Tm值反映了AtSOD1的何种结构状态仍不得而知。对人类和牛的SOD1的DSC研究显示，holo态的Tm值为92 ℃和96 ℃，apo态的Tm值为54 ℃和50 ℃[16-17]。上述结果和AtSOD1的结果非常类似，区别在于holo态AtSOD1的结果出现了比邻的双峰。结合尿素解折叠AtSOD1的CD结果来看，该Tm值可能与CD二级结构平台期的结果互为呼应，故进一步认为这些结果反映了SOD蛋白质从二聚体解聚为单体过程中的一个中间态。此外，对于apo态AtSOD1来说，Tm值为54.6 ℃，说明去除金属离子后，酶的稳定下降。以二硫苏糖醇(DTT)还原二硫键后，apo态AtSOD1的Tm值进一步下降为46.5 ℃，这表明金属离子和链间二硫键是SOD结构稳定的重要因素[13]。

reduced-apo态为二硫键被还原的apo蛋白

3 结论

本研究重点对At-SOD1酶的化学和物理稳定性进行了表征，发现了该酶由二聚体解折叠为单体过程中的一个中间态，且CD结果和DCS结果互为验证。推测认为，该中间态反映了酶由二聚体解聚为单体过程中的特殊状态，该发现尚属首次，其可能对于酶的结构稳定性起着一定的作用。

此外，本研究通过在培养基外源补充二价铜和二价锌离子，获得了具有完整结构的AtSOD1，无须通过铜离子螯合柱亲和层析纯化。纯化的酶蛋白反映出良好EPR光谱特征，满足EPR检测要求，为该酶的后续金属配位研究打下方法学基础。