流感嗜血杆菌单克隆抗体免疫层析试纸的研制

郝惠文， 陶 冶， 宋慧茹， 杨 波,2， 王 毅,2， 胡 征,2

(1. 湖北工业大学 生物工程与食品学院， 武汉 430068； 2. 湖北工业大学 发酵工程教育部重点实验室， 武汉 430068)

流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae，Hi)革兰氏阴性菌[1]是儿童和成人侵袭性肺部感染的主要病因之一[2]。已知的流感嗜血杆菌定植部位是人类上呼吸道和下呼吸道[3]，荚膜菌株中b型流感嗜血杆菌[4](Haemophilusinfluenzaetype b， Hib)和无荚膜型流感嗜血杆菌(Non-typeableHaemophilusinfluenzae，NTHi)[4]能引起脑膜炎、脓毒症、急性中耳炎、肺炎和结膜炎等疾病[5]。这显示了Hib和NTHi菌株在临床诊断的紧迫性与重要性[6]。 目前临床诊断流感嗜血杆菌感染的方法主要有“金标准”培养法[7]、血清学检测[8]和核酸检测[9]。这些方法存在检测时间过长、操作步骤复杂、成本较高等局限性。胶体金免疫层析法具有简便、快速、准确度高等优点，更适用于床旁检测。单克隆抗体的均一、稳定、高特异性等优点使免疫层析技术在病原诊断领域得到广泛应用。

流感嗜血杆菌的外膜蛋白P6是一种肽聚糖相关的脂蛋白，在不同荚膜血清型以及无荚膜菌株间表现出高度保守性和抗原性，被认为是检测流感嗜血杆菌的理想目标[10]。因此，本研究拟用单克隆抗体建立基于双抗体夹心免疫层析技术的流感嗜血杆菌快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 供试材料与菌株

重组蛋白P6-His，由本实验室构建并表达纯化[11]。8周龄的BALB/c雌性小鼠购自湖北省疾病预防控制中心。菌种：流感嗜血杆菌(H.influenzae，ATCC 49247)、肺炎链球菌(S.pneumoniae，ATCC 25238)、卡他莫拉菌(M.catarrhalis，ATCC 49619)、肺炎支原体(M.pneumonia，ATCC 15531)和嗜肺军团菌(L.pneumophila，ATCC 33152)均购自ATCC；金黄色葡萄球菌(S.aureus)、肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)、产酸克雷伯菌(K.oxytoca)、鲍曼不动杆菌(A.baumannii)和铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)均由湖北省武警总医院分离鉴定。

1.2 主要设备和试剂

Protein A亲和层析柱购自常州天地人和生物科技；Sephadex G25 凝胶填料购自 GE；羊抗鼠IgG购自武汉飞羿科技；亚型鉴定试剂盒购自Proteintech；Octet Red 96e分子相互作用仪购自ForteBio；硝酸纤维素膜(CN140)购自Sartorius；玻璃纤维膜(CB08)、吸水纸(CH37K)、PVC板(SM31-40)购自上海良信科技。

1.3 方法

1.3.1 单克隆抗体的制备和纯化

按常规方法用P6重组蛋白免疫BALB/c小鼠3次，取SP2/0与免疫小鼠脾细胞按1∶5比例混合进行细胞融合。分别以P6重组蛋白和灭活的Hi菌为包被抗原，经ELISA筛选及多次亚克隆，得到稳定目标抗体的杂交瘤细胞株。将筛选到的阳性杂交瘤细胞注射至已提前佐剂致敏的BALB/c小鼠腹腔，10～12 d后收集腹水，用Protein A 亲和层析纯化腹水，纯化后的抗体用紫外分光光度仪检测浓度，SDS-PAGE分析其纯度。

1.3.2 单克隆抗体的鉴定

2)Western Blot特异性鉴定。将离心收集Hi菌超声破碎，离心后分别收集超破后的菌体上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，以P6重组蛋白为阳性对照，转至PVDF膜，将制备的单抗分别作为一抗孵育，以HRP标记的羊抗鼠为二抗，通过ECL化学发光进行显影。

3)相互作用力检测。采用无标记分子相互作用仪对纯化后的单克隆抗体进行抗原抗体相互作用力检测。将鼠免疫球蛋白定量传感器(AMC)经缓冲液平衡后在纯化后的单克隆抗体中固化；洗去非特异性结合的杂质后再浸入含Hi菌缓冲液中进行结合；经平衡后在解离缓冲溶液中解离，利用仪器的分析软件得到动力学常数。用GraphPad Prism 7软件对数据进行整理生成结合解离曲线。

1.3.3 胶体金免疫层析试纸条的制备

用柠檬酸还原法制备40 nm胶体金[11]，并将抗体分别进行胶体金的标记及划线，进行组装、斩切形成0.4 cm的试纸条，加入干燥剂密封保存。

1.3.4 免疫层析试纸性能评估

1)特异性测试。用试纸条分别检测108CFU/mL灭活的Hi菌和其他9种呼吸道常见病原菌，鉴定试纸条的特异性。

2)灵敏性测试。用试纸条分别检测将从1.0×109至1.0×106CFU/mL不同浓度的Hi菌，以能观察到阳性结果的最低菌浓度作为试纸条的检测极限。

3)稳定性和重复性测试。将制备的3个批次的试纸条放置45 ℃储存，分别在间隔10、25和37 d时，用适当浓度的阳性样本和阴性样本检测试纸条的稳定性，根据公式推导其常温下的保存时间。

2 结果与分析

2.1 阳性杂交瘤细胞株的筛选

对融合后的细胞经培养7～9 d后，取其上清液通过间接ELISA测定，选取阳性数值较高的细胞株，经3次亚克隆最终得到2株稳定的分泌目的抗体的单克隆抗体细胞株，分别命名为Hi-1#和Hi-2#。

2.2 抗体的亚型及浓度测定

取两种纯化后的单克隆抗体，经鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒对制备的单抗亚类进行鉴定，其重链均为IgG1型，轻链均为Kappa型。用紫外分光光度仪测定两种抗体总量，分别为2.1和3.2 mg，经SDS-PAGE验证纯度在95%以上(图1)。

M：蛋白质分子量标准；1：Hi-1#；2：Hi-2#

2.3 单克隆抗体效价测定

表1 纯化后单克隆抗体效价测定ELISA结果

2.4 抗体的特异性鉴定

通过Western Blot鉴定两种抗P6蛋白单克隆抗体是否能与流感嗜血杆菌特异性结合(图2)。泳道1、4中均出现条带，且条带位置与表达纯化的P6-His蛋白大小一致，泳道2、3、5和6出现条带位置与文献报道的天然P6蛋白大小一致(约16 ku)。结果表明两种单克隆抗体均能够高特异性识别流感嗜血杆菌的天然P6蛋白。

2.5 抗体的亲和力鉴定

由图3和表2可知：两种单抗分别与流感嗜血杆菌相互作用力KD值分别为10-9和10-10，有较强的亲和力；解离速率常数(kdis)解离速率均在10-3～10-4，说明抗原抗体结合得很稳定；R2>0.9，说明拟合曲线与实际曲线拟合度高。由此可得两种抗体与Hi菌均有较好的亲和力。

M：彩色预染蛋白；1、4：P6-His蛋白；2、5：流感嗜血杆菌超破上清；3、6：流感嗜血杆菌超破沉淀。(a)Hi-1#；(b)Hi-2#

(a)Hi-1#；(b)Hi-2#

表2 生物膜干涉技术(BLI)检测数据结果

2.6 胶体金试纸特异性测试

制备的流感嗜血杆菌的试纸条，与Hi菌反应为阳性，与其他9种呼吸道常见病原菌的检测结果均为阴性，结果见图4。这表明制备的流感嗜血杆菌检测试纸条具有高的特异性。

图4 流感嗜血杆菌胶体金免疫层析试纸条的特异性检测

2.7 胶体金试纸灵敏度测试

在Hi菌的连续稀释液中，试纸条的检出限为1×107CFU/mL，结果见图5。

图5 流感嗜血杆菌胶体金免疫层析试纸条的检测灵敏度

2.8 胶体金试纸稳定性测试

随着存放时间的延长，检测线和质控线的颜色无明显变化，当45 ℃存放时间达到37 d时，检测线和质控线均正常(图6)，因此检测卡可在45 ℃储存37 d，根据经验公式，相当于在常温储存1年。

(a)45 ℃保存10 d；(b)45 ℃保存25 d；(c)45 ℃保存37 d

3 讨论与结论

研究表明无荚膜的NTHi菌株感染率逐年上升[13]，但缺乏较为简便、快速、稳定的检测方法。陶冶等[11]针对P6线性抗原表位设计得到多克隆抗体胶体金免疫层析试纸，有较高的灵敏度但是多抗特异性弱且不稳定。Zhao等[14]研究表明P6蛋白在所有H.influenzae间均有表达，其具有种属特异性、广谱表达性，该蛋白暴露在胞外，且具有较好的免疫原性。本研究确定以P6蛋白作为H.influenzae的检测标志物，采用单克隆抗体与胶体金试纸相结合，其优点在于单克隆抗体稳定性高且均一及特异性强，并且适合大规模生产。