气质联用和液质联用中基质效应研究进展

陈 鹏

（天津中医药大学第一附属医院，天津 300193）

近十年GC-MS 和LC-MS 技术愈来愈趋于成熟，现今已被广泛应用于生物基质中相关成分测定以及对食品、药品及烟草进行农药残留检测［1,2］，如动物和人体体内药物成分及药时曲线的测定、兴奋剂和毒性物质的检查、食品中农药或药物残留分析［3-5］。随着技术的革新与发展，困扰科研人员许久的专属性、灵敏度、同时测定多组分等问题在一定程度上得到的改善［6-8］，但这些按照法规要求的分析对准确性要求很高，尤其在药物代谢以及药代动力学领域；新药开发中需要依靠准确度得到保证的数据而作出决策及其相关措施决定，若准确度无法获得保障，显然会影响给药方案进而导致安全性、有效性方面的问题。然而无论在GC-MS中还是在LC-MS 中，基质效应（matrix effect）是造成分析结果不准确的主要因素之一。美国临床标准化委员会（NCCLS）将基质效应定义为：①样品中除了分析物以外的其他成分对分析物测定结果的影响；②基质对分析方法准确测定分析物能力的干扰，如黏度、表面张力、蒸汽压所带来的干扰（NCCLS EP14）。国际标准化组织（ISO）对“基质效应”所作定义为除被测定物质以外样本的特征，其能够影响被测物的检测及测定结果（ISO15181）。基质效应虽然可以在方法学考察阶段发现一些问题，但由于基质影响的复杂性和多样性，常规基质效应考察得到的结果亦不能完全反映基质的影响，对基质效应的关注和研究有待进一步深入。本文结合国内外有关基质效应的文献，对GC-MS 和LC-MS分析过程中基质效应的发生原因、基质效应的评价和怎样降低基质效应三方面进行综述。

1 基质效应的发生原因

1.1 基质效应的产生原理 目前，产生基质效应的真正原因并非十分清楚，但大家普遍接受的是在GC-MS中基质效应主要发生于进样口到色谱柱之间和色谱柱到检测器之间［9］。基质效应是待测样品会与硅醇基以及玻璃衬管表面金属正离子相互作用所导致的。与无基质的标准品注射相比，基质成分反而有利于被测样品转移至检测器，并在注入衬管和色谱柱时会掩蔽硅醇基活性位点，最大限度地减少吸附、分解；延缓极性化合物的分离；引起较高的分析信号。因此，在GC-MS中基质效应更多表现为基质诱导增强效应。

LC-MS 分析过程中的待分析样品流经色谱柱分离后，在离子源雾化器作用下会形成带电的微小液滴。电荷聚集在液滴表面与溶剂一起逐步挥发产生单个带电离子，最后完成离子化过程的样品进入质谱仪检测。在此过程中，基质的非挥发组分（如脂肪酸、甘油酸酯、盐类等）与被分析物一同流出喷雾针。非挥发组分与分析物之间存在两种竞争［10,11］：一种是到达雾滴表面带电离子之间的竞争；另一种是蒸发形成气态离子之间的竞争。这两种竞争阻碍分析物离子的形成效率，并且非挥发性基质组分将雾滴牢牢吸附在一起，阻碍雾滴进一步分裂为更小的微滴。因此，在LC-MS 中,基质效应更多表现为抑制现象。

还有一种理论［12-14］认为，待测样品中的干扰物浓度远远大于被分析物微量浓度，而这些高浓度的干扰物质增加了带电雾滴的黏度和表面张力，降低了溶剂挥发的效率，从而影响定量结果的准确性和可靠性。

1.2 影响基质效应的因素

1.2.1 样品成分的影响 不同样品的基质种类、组成、含量不同，其基质效应的主要来源不同，尿液基质效应主要来源于亲水残留成分（无机盐）；唾液基质效应主要来源于黏蛋白和氨基酸; 血浆基质效应主要来源于磷脂和抗凝剂; 组织匀浆基质效应主要来源于蛋白多糖和糖蛋白。在不同基质中，即使测定同一化合物也必然会有不同的结果，即不同样品基质之间的基质效应同样存在差异［15］。

1.2.2 分析物化学结构及性质的影响 即使在同一基质中，因为不同分析物化学结构和性质的差异，其基质效应都有很大不同。很多研究发现基质效应的大小与分析物的极性有关，分析物的极性越大，其基质效应越明显［16，17］。鲍忠赞等［18］对蔬菜水果中农药残留基质效应的研究中，选择了容易产生基质效应的27 种蔬菜和水果，利用气相色谱法测定14 种农药（7 种有机磷农药和7 种有机氯农药）在这些样品中的基质效应系数，结果绝大多数有机氯农药产生基质干扰效应，而有机磷农药大部分产生基质增强效应，其中辛硫磷的基质效应最强。Rahman 等［19］也指出气相色谱法测定有机磷农药的过程中基质效应的影响很大。姚勇等［20］同样利用气相色谱法分别测定七大类蔬菜基质对17 种有机磷农药的基质效应，其得出结论：七大类蔬菜（11 个品种）基质对氧乐果（CAS 号：1113-02-6）等8 种有机磷农药存在严重基质增强效应；对杀螟硫磷（CAS 号：122-14-5）等7 种有机磷农药有轻微基质增强效应，对敌敌畏有轻微基质减弱效应。

农药有效成分其主体化学结构多为硫代磷酸酯类结构；但对基质效应的影响不尽相同。有研究报道［21，22］称由于大多数有机磷类农药含有P=O 或P=S 等极性基团，含P=O 键的化合物引起的基质效应要比含P=S键化合物引起的基质效应强；并且与数量有关：具有单个P=O 键的化合物要弱于具有多个P=O 键的化合物。但从姚勇等［20］的结论中可以看出，亚胺硫磷（含P=S）的基质效应普遍高于氧乐果（含P=O）。据此可知，相关文献报道的“含P=O 键的化合物引起的基质效应要比含P=S 键化合物引起的基质效应强”等论述虽有一定道理，但并不全面。

整体的化学结构对其基质效应有更大影响，包括主要的极性基团、取代基、空间结构、诱导效应、共轭效应等，而非单一的某种因素。在亚胺硫磷和氧乐果化学结构中，P=S、P=O 分别作为主要极性基团参与硅醇基以及玻璃衬管表面金属正离子反应；2 个甲氧基作为给电子基团会使P=S、P=O 的极性变大；但是与P 相连的另一取代基中分别有邻苯二甲酰亚胺基、N-甲基氨甲酰基，其具有较强吸电子能力且N-甲基氨甲酰基＞邻苯二甲酰亚胺基；减弱S 的给电子能力；氧乐果的结构不可能为平面结构，在其立体结构中N 上的H 可能会和与P 相连的O 形成自身共价氢键影响给电子能力进一步降低P=O 的极性，最终导致氧乐果的基质效应低于亚胺硫磷。甲胺磷（CAS 号：10265-92-6）的结构中P=O 连接着氨基（-NH2）、甲氧基（-OCH3）、甲硫基（-SCH3）；这三个基团都为给电子基团使P=O 的极性变大，-NH2也会与硅醇基直接反应，掩蔽其活性位点。且若只考虑取代基，其基质效应应该强于亚胺硫磷和氧乐果。而姚勇等［20］的结论中甲胺磷的基质效应系数并不高。同样从立体结构角度考虑，氨基（-NH2）上的H极可能会与甲氧基（-OCH3）上的O 形成共价氢键抵消掉一部分基团给电子能力，减少了氨基（-NH2）与硅醇基的反应，且这种空间结构的影响不弱。再如甲基对硫磷（CAS 号：298-00-0），其化学结构中P=S 连接着2 个甲氧基（-OCH3）和对硝基苯氧基（-O-C6H4-NO2）；2个甲氧基（-OCH3）为给电子基团，对硝基苯氧基（-OC6H4-NO2）为强吸电子基团，极大地抵消了2 个甲氧基（-OCH3）的给电子能力，而立体结构对其影响不太大，故而导致了轻微基质增强效应。Hajslova 等［23］总结出农药含有特定基团如机磷酸基（P=O）、-N=、氨基（R-NH2）、氨基甲酸酯基（-O-CO-NH-）等会表现出较强的基质效应，而这些基团都有着共轭给电子能力使极性变大。

1.2.3 其他影响条件 不同的仪器、离子化方式、质谱参数、样品中加入的缓冲液或抗凝剂、样品的处理环境和处理方法、流动相、色谱条件、溶血及不合适的内标等都会对基质效应产生影响。

在LC-MS 中，利用不同仪器来测定同一样品，其基质效应也大不相同，这很可能与喷雾的位置有关。Vikas Trivedi 等［24］通过比较三种电喷雾离子源对磷脂产生的基质效应发现双正交喷雾（Z-spray）产生的基质效应最弱。Ghosh 等［25］研究了双正交喷雾（Z-spray）和正交喷雾（orthogonal spray）对于测定阿坎酸产生的基质效应，结果表明双正交喷雾与UPLC 或HPLC 联用时，表现出较强的基质抑制效应，而正交喷雾与UPLC联用则表现出轻微的基质增强效应。

样品的处理环境和处理方法对基质效应的影响也不容忽视。赵立波等［26］利用HPLC-MS/MS 法考察血浆样品预处理环境的pH 值对8 种芪类化合物基质效应的影响，结果显示8 种芪类化合物的基质效应强弱与预处理后的样品中磷脂的残留量呈正相关；在碱性条件下萃取处理的血浆样品磷脂残留量少，基质效应低，当pH 值为8.00 时，基质效应最低。Souverain 等［27］比较了蛋白沉淀法（PPT）、固相萃取法（SPE）、液液萃取法（LLE）不同的样品前处理方式在相同条件下对基质效应影响，结果表明：相对而言，LLE 方法可以最大限度地减小基质效应的影响。徐冉驰等［28］采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）定量分析大鼠血浆中复方鹿角颗粒14 种主要成分,比较4 种不同前处理方法的基质效应对其影响；结果表明采用微固相萃取法，样品基质效应对测定方法影响小，可以作为复方鹿角颗粒中14种主要成分在大鼠体内血药浓度测定和药代动力学研究的样品前处理方法。

刘小娟等［29］报道了溶血样品对基质效应的影响；溶血血浆中溶出的血红蛋白、磷脂等生理成分作为内源性干扰物质会造成离子抑制或增强效应；同时，溶血样品的影响也受到了各国的广泛关注，而《中国药典》（2015 版）中《生物样品定量分析指导原则》规定“除正常基质外，还应关注其他样品的基质效应，例如溶血血浆样品的基质效应［30］。

2 基质效应的评价

针对基质效应的评价，各个国家的法规中并没有统一的规定要求，仅仅只是规定了精密度和准确度；我国国家食品药品监督管理总局（SFDA）要求对ESI 或APCI 电离方式的检测法进行基质效应的考察，但采用何种方式也并未作出明确规定。目前，主要有两种基质效应评价方法存在分析领域［8］：一种是柱后灌注法（post-column infusion method），这种方法属于动态分析基质效应的定性方法；另一种是提取后加入法（postextraction spiking method），这种方法属于静态分析基质效应的定量方法；后又被Matuszewskhi 等［31］进一步发展为绝对基质效应（absolute ME）和相对基质效应（relative ME）。

柱后灌注法是1999 年时Bonfiglio 等［32］提出，被沿用至今。在质谱仪和液相色谱系统间串联T 型阀，待测分析物的纯标品溶液通过针泵以恒定流速注入质谱仪（因为是纯标品，此时质谱会产生稳定的基线响应）；将空白基质按样品处理方法提取后正常进样，流经色谱柱洗脱，再与待测分析物一同注入质谱仪；此时，基线响应会有所波动：若出现峰，则表现为基质增强效应；若出现谷，则表现为基质抑制效应。

提取后加入法是计算待测分析物加入到空白基质提取液中的响应与其纯标品溶液响应的比值来评价基质效应的，该方法在LC-MS 的基质效应评价中使用最多。其中，绝对基质效应体现的是基质效应对定量分析的影响程度，主要影响分析方法的准确度。

两组样品：其中一组是待测分析物的纯标品溶液（含内标），其进样测定的峰面积记为A，另一组提取空白基质真空浓缩复溶后，将待测分析物和内标加入此溶液进样测定的峰面积记为B，则绝对基质效应（absolute ME）=（B/A）×100%；也可用基质效应因子（MF）来表示。若MF＞100%，则表明离子增强效应；若MF＜100%，则表明离子抑制效应。在做方法学时，对MF 的要求为MF 的变动不超过15%。

依照2009 年医药产品对人用委员会（CHMP）和欧洲药品管理局（EMEA）发布的《生物分析方法验证指导原则（草案）》相关规定，相对基质效应是比较5 个不同来源基质提取后加入待测分析物的信号响应差异来评价。若5 个不同来源样品所构建的标准曲线斜率的相对标准偏差不超过3%～4%，可以认为没有相对基质效应。内标归一化基质效应因子（IS-normalized MF）的相对标准偏差也可以评价相对基质效应；选用至少6 个不同来源的空白基质，分别测定基质中待测分析物和内标的MF 值（选择待测分析物的浓度应在3×LLOQ以内）；归一化基质效应因子=待测分析物MF/内标MF，再进一步计算内标归一化基质效应的相对标准偏差，其值应在±15%以内。

3 降低基质效应的方法

基质效应的存在必然会给样品的测定带来影响，在实际的分析过程中，因为种种原因，不可能完全消除基质效应；如样品中非待测组分不可能完全根除以及色谱柱非惰性性质等，但仍然可以采取相关措施降低基质效应对测定的影响，从而获得更准确的结果。Paul Yang 等［34］提到在LC-MS 中待测分析物和基质效应有效浓度的最高限度为1×10-5mol/L（6.02×1018带电离子/L），当有效浓度＜1×10-5mol/L 时不会产生基质效应；当有效浓度＞1×10-5mol/L 时就会产生电荷竞争导致基质效应。

3.1 优化样品前处理 样品前处理过程会影响到残留基质成分的多少，在GC-MS 中，基质成分掩蔽活性位点；而在LC-MS 中，基质成分与待测分析物一同流出喷雾针雾化竞争电荷；因此样品前处理后残留基质成分的多少与基质效应的强弱有重大的关联。随着基质效应相关研究的深入，在常规的样品前处理方法基础上又发展了众多有效的处理方法：丙酮超声破碎法（ultrasonication in acetone）、加速溶剂萃取法（ASE）、微波辅助萃取法（MAE）、液液微萃取法（DLLME）、基体固相分散萃取法（MSPD）、固相微萃取法（SPME）以及超临界流体萃取法（SFE）和QuEChERS 法等［35］，尤其是QuEChERS 法，其涵盖了常规样品前处理的过程，减少了许多操作步骤，降低了样品的损失；已被广泛应用于GC-MS 和LC-MS 中［36］。

Shafeeque Ahmod 等［37］探索出一种样品前处理方法（HybridSPE），该方法结合了化学沉降和固相萃取法的优点，与常规沉淀蛋白法相比，此方法能够显著减少生物样品中的残留磷脂成分进而导致基质效应显著下降。总之，样品前处理的优化不可盲目，要根据待测分析物的性质、种类、仪器的情况等多重因素考虑。

3.2 优化色谱条件 针对LC-MS，待测分析物与基质成分流经色谱柱，会因极性不同而先后流出色谱柱进入质谱测定；若使两者之间的峰完全分离同样可以显著降低基质效应，即减少待测分析物进样测定时基质进入离子源的量。

李丹等［38］利用LC-MS/MS 法测定人血浆中氨氯地平浓度实验中，仅由等度洗脱变为梯度洗脱分离基质成分和待测分析物从而大幅度降低了该方法中基质效应的影响。在摸索色谱条件时，采用梯度洗脱往往会比等度洗脱的效果更好，流动相的选择、pH、流速等［39,40］都会对基质效应产生影响。

色谱柱作为色谱系统的核心，因其种类的不同，柱效和分离效果也有很大不同：如UPLC 相较于HPLC而言柱效高、分离效率高；能使基质成分与待测分析物更好地分离，更好地降低基质效应。HILIC 也可以使极性化合物的峰后移并去除小杂质分子从而有效降低基质效应。也有相关文献报道［41］，过流动相中的“电解质效应”（LC-electrolyte effects），即少量电解质的存在能够有效降低基质效应。

3.3 保护剂法 在GC-MS 中加入高极性化合物如聚乙二醇、缩三甘油、D-山梨醇等保护剂可有效降低基质效应。其原理为这些高极性化合物会与待测分析物产生活性位点的竞争，提高溶剂中待测分析物的响应值。这些高极性的保护剂并非仅能单独使用，可以多种混合使用来达到降低基质效应的目的。

3.4 基质标线校准法 无论在LC-MS 还是GC-MS的检测中，基质标线校准法都是降低和校正基质效应的强有力方法。该方法是先将与待测分析物匹配的空白基质样品按样品处理操作进行，浓缩后的提取物用系列梯度的标准液（复溶溶剂）定容，配制成基质标准曲线，再用这条基质标准曲线进行样品计算。Masia A等［42］利用GC-MS 测定土壤中农药残留时，样品前处理方法采用QuEChERS 法；利用基质匹配校准曲线计算得到的回收率为80%左右，基质效应小于20%。然而在Lozowicka B 等［43］利用GC-MS 测定土壤中农药残留实验中，同样采用QuEChERS 法和基质匹配校准曲线法，测得的结果：回收率在65%～116%；基质效应在-25%～74%；这种结果极可能是因为选择的空白基质的特性有很大差异。

此方法还有一些其他缺陷：在实际测样过程中，很难找到与待测分析物类型一致的空白基质，这种方法同样忽视了因浓度差异可能产生的影响。

3.5 选择合适的内标 为了保证结果的准确度，往往会采用内标法来校正测定过程中的误差。然而内标选取不当依然会对基质效应产生很大影响。一般来讲，选取的内标物质应当和待测分析物有着尽可能一致的物理化学性质（如极性、溶解度、化学结构等），且能与各组分充分分开，不少分析人员可能更关注于复杂过程中的提取回收率，而忽视了内标的选择原则。

在LC-MS 中，待测分析物的同系物常被用来当作内标使用；但也存在两者离子化行为不同的现象，进而对基质效应产生影响。目前同位素标记内标被认为是一种最有效降低基质效应的方法［44,45］。同位素标记的内标化合物与待测分析物的物理、化学性质基本类似，在样品前处理过程中和离子化过程中受到的影响也大致相同，即可以认为二者受到的基质效应的干扰是一致的。在整个过程中，样品待测组分与同位素标记的标准品组分响应的比值是不变的，故同位素内标法可以很好地抵消样品前处理和离子化过程中基质效应带来的差异。Abe K 等［46］在利用LC-MS 测定成人、儿童尿液中肉毒碱、酰基肉毒碱、头孢托仑实验中，使用氘代标记物（2H9-carntine，2H3-hexanoylcarnitine，2H3-stearoylcarnitine）校正基质效应，成人组基质效应和提取回收率为91.2%～102%和98.3%～105%；儿童组基质效应和提取回收率为94.2%～104%和99.3%～102%，其相对标准偏差均小于12%。

然而即使稳定同位素标记法也不总能有效地降低或校正基质效应，N.Lindegardh 等［47］用LC-MS 测定血浆中哌喹时发现样品经固相萃取后残留的三乙胺依然会影响氘代内标法的校正；对血浆中真实浓度的低估程度达50%。同样Berg 等［48］也注意到氘代内标物与分析物在色谱分离时的保留时间有些许差异，并随着氘代的数目增多对其影响越大，导致不能有效地校正基质效应。这可能与化合物的结构和极性、流动相pH、氘代位置有很大的关联。

随着稳定同位素内标法的发展，越来越多的同位素应用其中且效果比2H 更好，如13C、15N、18O、34S 等［49，50］，然而同位素内标物价格昂贵或合成不稳定等种种因素限制了其广泛使用。

无论在GC-MS 还是LC-MS 中，基质效应都会对分析过程产生很大影响。为了确保分析结果的准确性，往往要综合考虑处理方法、色谱质谱条件、内标等多种因素，同时也要注意方法间的相互干扰，尽可能地降低基质效应的影响；总之，对基质效应的研究有待进一步深入，开发出更、高效更简化的方法。