miR-212-3p靶向长链非编码RNA SCAMP1在胃癌中的差异表达 ①

戴 凌 ， 蒋志庆， 甘信利

(桂林医学院附属医院胃肠外科，广西 桂林 541001)

胃癌(Gastric cancer， GC)是中国常见的消化道系统恶性肿瘤[1]，目前早期的GC诊断依然困难重重，大多数的患者仍处于晚期阶段才被诊断出来，且治疗效果并不理想。因此鉴定新的分子生物标志物和探索GC发病机制对于早期的诊断和治疗都有着重要的意义。

非编码RNA中的微小RNA(microRNA， miRNA)和长链非编码RNA(long non-coding RNA， lncRNA)在多种肿瘤的发生发展中起重要作用，miRNA可以与LncRNA相互调控，在肿瘤中发挥促癌基因或者抑癌基因作用[2]。已有研究证明，miR-212-3p在胃癌中低表达，其表达水平跟胃癌的淋巴转移呈负相关[3]。本研究通过生物信息学方法进行分析，预测miR-212-3p潜在的靶向调控LncRNA；通过COX风险模型研究miR-212-3p和其靶向调控的LncRNA在胃癌发生发展中的作用，为了解miR-212-3p和LncRNA在胃癌的预后机制中提供有价值的线索。

1 资料与方法

1.1 生物信息学分析

通过starBase 2.0预测miR-212-3p的靶向LncRNA，使用COX风险模型分析预测LncRNA和miR-212-3p对胃癌患者生存时间的影响。

1.2 标本采集

选择2016年1～3月于本院肿瘤科就诊的56例胃癌患者，均排除化疗、放疗、使用激素患者，所有胃癌患者均经病理检查确诊为胃癌患者。每例标本取肿瘤组织及对应的距肿瘤5 cm以上的癌旁正常胃黏膜组织(简称远癌组织)。样品置于-80 ℃保存。

1.3 Real-time PCR检测miR-212-3p、SCAMP1的表达

将取得新鲜的胃癌组织及远癌组织液氮研磨，参照Trizol试剂盒说明书提取组织中的总RNA，使用NanoDrop 2000c测定 RNA的纯度和浓度。按照逆转录试剂盒说明书步骤逆转录总RNA至cDNA，反应条件为16 ℃、30 min，42 ℃、40 min，85 ℃、5 min。取逆转录产物进行SYBR-PCR扩增，反应条件：95 ℃预变性10 min；40个PCR循环(95 ℃，10 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s)，miR-212-3p以U6为内参，SCAMP1以GAPDH为内参。引物交由上海生工设计合成，数据采用2-△△ct法进行分析。详见表1。

表1 引物序列

2 结果

2.1 生物信息学分析结果

通过starBase 2.0预测miR-212-3p靶向SCAPM1等21个LncRNA。详见图1。

将miR-212-3p和预测到的21个LncRNA进行COX回归分析，结果显示miR-212-3p风险比无统计学意义(P=0.97)，SCAMP1风险比有统计学意义(RR=1.19，P=0.034)。详见表2。

采用TCGA数据库进行SCAMP1表达的胃癌患者生存分析，结果显示：SCAMP1低表达患者中位生存时间(921±21)d，明显高于SCAMP1高表达患者中位生存时间(615±11)d，(P=0.0031)。详见图2。

图1 miR-212-3p靶向LncRNA的交互作用图

表2 miR-212-3p和SCAMP1的COX回归模型参数估计表

图2 SCAMP1在250例胃癌患者生存曲线图

2.2 Real-Time PCR 验证结果

56例胃癌患者，男43名，女13名；平均年龄(47.23±5.26)岁。Real-Time PCR结果显示：miR-212-3p在胃癌组织中低表达， SCAMP1在胃癌组织中高表达(P<0.05)。详见图3，图4。

与远癌组织比较，* P<0.05图3 miR-212-3p 在胃癌组织和远癌组织中相对表达

与远癌组织比较，* P<0.05图4 SCAMP1在胃癌组织和远癌组织中相对表达

3 讨论

miRNA、LncRNA属于高度保守的非编码小分子单链RNA，并广泛存在于真核生物中[4]。正常生理状态下，机体内miRNA、LncRNA表达遵守严格的组织、时序特异性[5]。但在肿瘤环境下，不同miRNA、LncRNA则表现出不同的生物学活性[6]，并起到类似促癌基因或抑癌基因的作用。

在竞争性内源性RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)假说中，阐述了mRNA、lncRNA和miRNA之间的作用：lncRNA中含有与miRNA反应类似的元件，进而可作为ceRNA与miRNA竞争性结合，共同对编码基因的表达进行调控，在肿瘤的发生发展中起到重要的作用[7]。Yang等[8]研究显示LINC00703作为miR-181a的ceRNA，可以在胃癌细胞中上调KLF6表达来发挥抑癌作用。Shi等[9]发现LncRNA PAPAS在胃癌中表达上调，并与胃癌患者的淋巴转移、远处转移及预后不良密切相关。PAPAS通过负调控miR-188-5p水平加重胃癌的进展。lncRNA SNHG8通过靶向miR-491/PDGFRA轴促进了GC细胞的增殖和侵袭[10]。

蒋佩佩[11]研究表明胃癌组织中 miR-212-3p与淋巴结转移呈负相关，提示miR-212-3p在胃癌的发生与发展过程中发挥着抑癌基因的功能， Wada等[12]通过miRNA芯片方法分析胃癌组织和正常胃组织，发现 miR-212-3p可能通过下调MECP2，与胃癌的发生相关联。Ma[13]等研究表明miR-212-3p在胰腺癌中高表达，且高表达 miR-212-3p促进胰腺癌细胞增殖和侵袭；miR-212-3p在急性髓系白血病高表达，能促进患者预后[14]。赵健丽[15]研究发现过表达miR-212-3p后，细胞克隆形成能力减弱、细胞周期 G1/S 进程阻滞，而且细胞的迁移和侵袭能力也减弱，并抑制上皮细胞向间质细胞转化的进程，miR-212-3p通过靶向SMAD2发挥抑癌作用。这表明miR-212-3p在不同肿瘤中发挥不同作用。

本研究通过生物信息学预测miR-212-3p靶向的LncRNA，包括SCAMP1在内的21个LncRNA。运用COX风险模型分析，结果显示SCAMP1在胃癌中风险比为1.19，miR-212-3p风险比无统计学差异，提示miR-212-3p可能通过靶向SCAMP1与胃癌患者的预后有关。生存分析显示，低表达的SCAMP1可以显著性增加患者生存时间，说明SCAMP1可能在胃癌中起促癌作用。

本研究预测并验证胃癌组织中高表达的LncRNA-SCAMP1，是胃癌中首次报道的差异LncRNA。后期需要FISH技术对SCAMP1在细胞内进行共定位，分别对SCAMP1及miR-212-3p进行干扰及过表达，对凋亡相关靶向基因进行更深入的研究。