小麦籽粒PPO活性检测方法改良与应用

翟胜男，李豪圣，宋健民，刘爱峰，曹新有，程敦公， 赵振东，何中虎，夏先春，刘建军

(1.山东省农业科学院作物研究所，山东济南 250100；2.中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081)

色泽是小麦面粉及面制品品质评价的重要指标[1-2]。小麦籽粒多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)催化酚类物质发生氧化还原反应产生醌类物质或催化多酚类变为氧合醌，后者发生自身非酶促聚合或与蛋白质氨基酸残基或糖类发生反应，产生褐色或黑色的沉积物，是造成面粉及其制品酶促褐变的最主要原因[3-6]，可以解释面粉及其制品加工储藏过程中50%～70%的颜色褐变[7-8]。PPO不仅影响面制品表观色泽，还影响食品特性及营养品质，因而倍受面粉加工企业和育种家的关注[9-10]。培育低籽粒PPO活性小麦品种，是对面制品色泽性状进行改良的重要途径，已成为小麦品质育种的重要目标。如何准确、快速、简便地测定小麦籽粒PPO活性，是育种家们急需解决的问题。

利用分光光度法，以邻苯二酚和L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA，L-dihydroxyphenylalanine)为底物，是目前测定小麦籽粒PPO活性最为常见的两种方法[11-12]。Kruger等[7]和McCaig等[13]提出以邻苯二酚为底物进行小麦籽粒PPO活性的测定，该方法大大提高了PPO活性检测的精度和效率，操作简便，费用低。Anderson和Morris[14]及Bettge[15]提出以L-DOPA为底物测定小麦籽粒PPO活性，进一步提高了小麦籽粒PPO活性检测精度，该方法已被美国谷物化学协会(AACC，American Association for Cereal Chemistry)作为标准方法(AACC 22-85)，被广泛应用。AACC分析方法第11版中，将其修订为AACC 22-85.01[16]。

然而，分光光度法测定PPO活性的检测通量很低，只能对样本逐个进行检测，操作繁琐，测定时间长，工作量大，检测效率低。酶标仪工作原理和分光光度计类似，且具有操作简便、精度高、样品微量、检测效率高等优点，已被广泛应用于三角褐指藻油脂含量、食用菌多糖含量、大豆总皂甙含量等的检测[17-19]。

为了提高检测效率和稳定性，为PPO活性高通量检测和面制品色泽性状遗传改良提供技术支撑，本研究将酶标仪检测技术应用于小麦面粉PPO活性测定，对传统AACC 22-85.01法进行改良，并对改良方法的有效性进行了验证，利用改良方法对283份国内外小麦品种进行PPO活性检测，筛选籽粒PPO活性较低品种，为培育低籽粒PPO活性小麦品种的亲本选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

根据前人研究，选用26个籽粒PPO活性变异范围较大的小麦品种，包括衡观33、淮麦21、冀师02-1、兰考906、临麦2号、鲁麦21、鲁麦8号、洛旱2号、陕354、陕715、ProINTA Colibr 1、陕麦94、Aca 601、石新733、泰山1号、皖麦33、小偃22、小偃54、宿0663、烟农19、豫麦2号、郑9023、中麦871、中育5号、周麦25和淄选2号，分别采用传统AACC 22-85.01法[17]与改良方法测定PPO活性，用于验证改良AACC 22-85.01法的准确性。选用144份我国黄淮麦区小麦品种，用于分析改良方法的重演性和稳定性。对283份具有代表性的国内外小麦品种用改良方法进行籽粒PPO活性检测。根据生育期和春冬性不同，于2012—2013和2013—2014年度进行分区种植。其中，144份我国黄淮麦区小麦品种种植于河南安阳和安徽濉溪；42份北部冬麦区品种和48份国外品种种植于北京和河北石家庄；49份长江中下游麦区品种种植于安徽濉溪和四川成都。

所有供试材料采用随机区组设计，3次重复，4行区，行长2 m，行距25 cm。试点均经过多年的科学管理和改善，土壤地力充裕，肥力均匀，田间管理同大田生产。对收获籽粒进行磨粉，用于PPO活性测定。

1.2 制 粉

应用单籽粒谷物特性测试仪SKCS 4100(Perten，Sweden)测定籽粒硬度。利用近红外分析仪Foss-Tecator 1241(Sweden)测定籽粒蛋白质含量和含水量。根据硬度等级计算润麦所需加水量：软质麦(硬度指数<40)为14%、混合麦(40<硬度指数<60)为15%、硬质麦(硬度指数>60)为16%。室温润麦16～18 h，应用Junior实验磨(Branbender，Germany)制粉，出粉率约为60%。面粉4 ℃保存，用于PPO活性检测。

1.3 PPO活性测定

分别利用传统AACC 22-85.01法[17]与改良方法测定26个籽粒PPO活性变异范围较大的小麦品种的籽粒PPO活性。

传统AACC 22-85.01法[17]：5粒完整小麦种子置于2 mL离心管中；加入1.5 mL反应试剂[50 mM MOPS(3-N-Morpholino propanesulfonic acid，pH 6.5)缓冲液配制的10 mM L-DOPA(L-3,4-dihydroxyphenyl alanine)]；离心管放入往复振荡器上，振荡1 h，样品充分暴露在空气中；吸取1 mL反应液加入比色皿中，以L-DOPA/MOPS溶液作为对照，利用分光光度计测定反应液在475 nm下的吸光值。每个样品重复2次，均值作为样品PPO活性的表型值。如果两个吸光值差异大于0.15，则进行第三次测定。

参照Mohammadi等[20]方法，对传统AACC 22-85.01法[17]进行改良，具体步骤如下：

(1)称取0.2 g面粉置于50 mL离心管中；

(2)加入1.5 mL反应试剂[50 mM MOPS(3-N-Morpholino propanesulfonic acid，pH 6.5)缓冲液配制的10 mM L-DOPA(L-3,4-dihydroxyphenyl alanine)]，迅速旋涡振荡、混匀；

(3)将50 mL离心管放入往复振荡器上，200 r·min-1、22 ℃振荡30 min，样品充分暴露在空气中；

(4)将反应液迅速转移至预先冷却的2 mL离心管中，并插入冰中5 min终止反应；

(5)反应液在冷冻离心机中4 ℃ 5 000 r·min-1离心10 min；

(6)吸取200 μL上清液加入96孔酶标板(Costar 3590，USA)，以L-DOPA/MOPS溶液作为对照，利用酶标仪SpectraMax Plus 384(Molecular Devices，LLC，USA)测定上清液在475 nm下的吸光值，计算PPO活性值，单位为 U·g-1·min-1。

L-DOPA现配现用。应用改良方法测定283份国内外小麦品种籽粒PPO活性，每个样品重复3次，均值作为样品PPO活性的表型值。

1.4 统计分析

利用SAS V9.2(http://www.sas.com)软件进行PPO活性基本数据分析，利用PROC CORR程序进行相关性分析，应用PROC GLM程序进行方差分析。利用Microsoft Excel软件进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 传统AACC 22-85.01法与改良方法所测PPO活性比较

对两种方法所测26个小麦品种籽粒PPO活性进行比较，结果如图1所示，传统方法所测PPO活性值较高，平均值为11.51 U·g-1·min-1，变化范围为6.04 U·g-1·min-1～ 19.16 U·g-1·min-1，相对标准偏差为 0.03%～6.16%，变异系数为 32.3%。改良方法所测PPO活性值较低，平均值为5.63 U·g-1·min-1，变化范围为3.35 U·g-1·min-1～8.80 U·g-1·min-1，相对标准偏差为0.11%～ 4.92%，变异系数为27.9%。两种方法所测PPO活性呈极显著正相关(R=0.982，P<0.001)。

图1 两种方法所测PPO活性的相关性Fig.1 Correlation of PPO activities measured by the two methods

由表1可知，重复对两种方法的检测结果均无显著影响，说明试验过程人为因素影响很小。品种对两种方法所测小麦籽粒PPO活性值均有极显著影响。

2.2 传统AACC 22-85.01法与改良方法的差异性比较

如表2所示，与传统AACC 22-85.01法相比，改良AACC 22-85.01法以面粉为试验材料，反应时间缩短至30 min，应用96孔板和酶标仪代替比色皿和分光光度计，同时可检测多个样本，大大提高了检测效率。

2.3 改良AACC 22-85.01法测定PPO活性稳定性分析

为了分析本研究改良AACC 22-85.01法测定PPO活性的稳定性和可靠性，应用此方法对144份我国黄淮麦区代表性小麦品种的PPO活性进行重复测定。结果如图2所示，三次重复间PPO活性相关系数高达0.993～0.994，呈极显著正相关(P<0.001)，表明改良AACC 22-85.01法测定PPO活性重复性好，稳定性高。

表1 两种方法测定PPO活性的方差分析Table 1 Analyses of variance of PPO activities measured by the two methods

表2 两种PPO活性测定方法比较Table 2 Comparison of the two methods for detecting PPO activity

图2 改良AACC 22-85.01法测定PPO活性3次重复间的相关性Fig.2 Correlation of PPO activities between three replicates measured by the modified AACC 22-85.01 method

2.4 283份国内外小麦品种PPO活性分析

由表3可知，283份国内外小麦品种籽粒PPO活性变异范围广，遗传基础丰富。黄淮麦区小麦品种PPO活性为1.98 U·g-1·min-1～ 9.37 U·g-1·min-1，平均值为4.72 U·g-1·min-1；北部冬麦区小麦品种PPO活性为1.72 U·g-1·min-1～8.76 U·g-1·min-1，平均为4.34 U·g-1·min-1；长江中下游麦区小麦品种PPO活性为1.89 U·g-1·min-1～8.40 U·g-1·min-1，平均为3.86 U·g-1·min-1；国外小麦品种PPO活性为1.92 U·g-1·min-1～10.47 U·g-1·min-1，平均为5.85 U·g-1·min-1。

同一品种不同环境间PPO活性的相关系数为0.65～0.97。比较各个品种在不同环境下PPO活性值，发现在不同环境间稳定且PPO活性较低的品种34个(表4)，可作为培育低籽粒PPO活性小麦新品种的优异资源。

表3 283份小麦品种PPO活性Table 3 PPO activity of the 283 wheat varieties

表4 具有低PPO活性的小麦品种Table 4 Wheat varieties with low PPO activity

3 讨 论

小麦籽粒PPO是造成面制品颜色褐变的最主要原因，培育低籽粒PPO活性品种已成为小麦品质改良的重要目标[21]。目前，对小麦PPO的研究主要集中在PPO活性与面制品色泽的关系[4,6,8]、QTL定位[22-24]、基因克隆及分子标记开发[25-27]等方面。准确、快速、稳定、简便的PPO活性检测方法是上述研究的基础。

测定PPO活性的方法主要分为两大类，耗氧电极法和分光光度法[15]。耗氧电极法主要是由于PPO催化反应需要消耗氧，溶液中氧浓度的减少速率与酶活力大小成正比，因而可以用单位时间内的耗氧量来表示PPO活性[12]。该方法精度极高但测定时要严格控制反应温度。此外，新磨制的面粉由于脂肪氧化酶活性较强，其催化不饱和脂肪酸的过氧化反应也耗氧，对测定结果可能有一定影响。而分光光度法主要是测定单位时间内PPO催化酚类反应产物吸光度的变化来反映

PPO的活性[13,28]，可以用不同的化学试剂为底物进行PPO活性测试。AACC22-85.01法[17]以L-DOPA为底物，利用分光光度计测定小麦籽粒PPO活性，由于操作简便、快速等特点被广泛应用[12]。本研究对AACC 22-85.01法进行了改良，利用酶标仪检测PPO活性，结果显示，两种方法测定的PPO活性呈极显著正相关，且改良法所测PPO活性的相对标准偏差较小。用改良法重复测定144份小麦品种PPO活性，三次重复间相关系数高达0.993～0.994，表明该方法重复性好，稳定性高。此外，改良法应用96孔酶标板和酶标仪来测定PPO活性，无需更换清洗比色皿，大大减少工作量，同时可检测多个样本，缩短检测时间，避免因测定时间过长而导致的误差，检测效率提高约12～15倍。因此，本研究改良的AACC 22-85.01法具有准确可靠、精密度高、重复性好、检测效率高等优点，可以代替传统方法用于小麦籽粒PPO活性的高通量检测，为小麦品种资源筛选和面制品色泽改良提供技术支撑。

张 晓和田纪春[29]研究表明，面粉PPO活性与面制品色泽及色泽变化的相关性最大。因此，在低籽粒PPO活性小麦育种工作中，利用本研究改良的AACC 22-85.01法对高代育种材料面粉进行PPO活性测定和筛选，可更准确预测面制品颜色褐变程度，提高育种选择的精准度。此外，本研究对283份国内外小麦品种籽粒PPO活性进行了检测，结果表明，供试品种PPO活性变异范围广，遗传基础丰富。共筛选出在不同环境间PPO活性均较低且稳定的小麦品种34份，可作为低籽粒PPO活性小麦品种选育的重要亲本 资源。