枸杞类胡萝卜素的分离纯化及抗氧化活性研究

孙宇杰，赵琳， 王岁楼

（中国药科大学工学院，江苏南京 211198）

枸杞是常用的药食两用材料，具有重要的保健价值。据研究报道[1-2]，枸杞含有包括枸杞多糖和类胡萝卜素在内的许多生物活性物质，但目前对枸杞生物活性成分的研究主要集中于对枸杞多糖的提取与利用方面，对枸杞类胡萝卜素的研究相对较少。试验对枸杞中类胡萝卜素进行了初步的提取与抗氧化活性探讨，旨在为枸杞综合利用及其类胡萝卜素开发应用提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干枸杞，产地宁夏，购于南京市场，使用料理机将干枸杞破碎至粒径比较均匀，装入塑料自封袋，放入5 ℃冰箱中冷藏，备用。

其他试剂：石油醚、丙酮、正己烷、DPPH、β -胡萝卜素标准品等，均为分析纯；硅胶100～300 目、中性氧化铝100～200 目。

1.2 仪器与设备

JVL-C051 型料理机、TGL-16G 型台式离心机、RE-5205 型旋转蒸发器、DNG-9070A 型电热恒温鼓风干燥箱、UV754N 型紫外可见分光光度计等。

1.3 类胡萝卜素粗提液的制备

按前期优化试验确定的提取方法，准确称取1.000 g 的干枸杞碎粒，置于试管中，按照1∶20（g/mL） 料液比加入石油醚∶丙酮= 5∶1 （V/V） 混合溶剂，在45 ℃水浴下提取2 h，以转速5 000 r/min离心5 min 后取上清液，得到枸杞类胡萝卜素粗提液。吸取5 mL 置于25 mL 容量瓶，用提取溶剂定容，以提取溶剂调零，于波长450 nm 处测量吸光度OD 值，重复3 次作平行试验，按下式计算类胡萝卜素含量：

式中：C——将吸光度值代入β - 胡萝卜素标准曲线得到的质量浓度，μg/mL；

V——定容体积，mL；

N——稀释倍数；

m——干枸杞质量，g。

1.4 粗提液的分离纯化

分别对柱层析方法及洗脱剂、柱填料、上样量进行筛选，纯化倍数按下式计算：

式中：C1——将纯化后类胡萝卜素溶液的吸光度代入β - 胡萝卜素标准曲线，得到的类胡萝卜素质量浓度，μg/mL；

C2——将纯化前类胡萝卜素溶液的吸光度代入β - 胡萝卜素标准曲线，得到的类胡萝卜素质量浓度，μg/mL；

V1——纯化后类胡萝卜素定容的体积，mL；

V2——纯化后类胡萝卜素定容的体积，mL；

m1——纯化后收集的色素液旋干后测得的干燥品质量，g；

m2——纯化前粗提液旋干后测得的干燥品质量，g。

1.5 抗氧化活性测定

分别参考米雪等人[3]、吴灿军[4]的方法，测定DPPH自由基、羟自由基清除率。按下式计算：

所有试验均重复3 次，数据为3 次试验结果的平均值。采用Excel 2010 进行数据的汇总整理，使用Origin Pro 2016 进行标准曲线的线性拟合及制图，应用SPSS 25 进行概率单位回归分析和相关性分析，计算自由基的半清除率浓度IC50值并分析枸杞类胡萝卜素质量浓度和自由基清除率的相关性。

2 结果与分析

2.1 粗提液的柱层析分离纯化

2.1.1 上样量对纯化倍数的影响

上样量对柱层析纯化倍数的影响见图1。

由图1 可知，上样量0.5，1.0，1.5，2.0 mL 均有纯化效果，随着上样量从0.5 mL 增加到1.0 mL，纯化效果不断提升，但当上样量增加到1.5 mL 后纯化效果持续降低。说明在试验条件下，当上样量达到1.5 mL 以上时硅胶已经吸附饱和，不能很好地分离纯化。因此，合适的上样量为1.0 mL，此时纯化倍数为1.10 倍。

2.1.2 洗脱剂种类对纯化倍数的影响

洗脱剂种类对纯化倍数的影响见图2。

由图2 可知，丙酮和石油醚、丙酮和正己烷的混合洗脱效果同单一丙酮的洗脱效果没有显著差异。但单一正己烷的洗脱效果和其他洗脱剂相比差距明显，在柱层析过程中亦可观察到洗脱的速度缓慢并且在硅胶柱顶端有色素残留，产生了较大损失。因为正己烷是弱极性的有机试剂，并且在枸杞类胡萝卜素中，分子结构含氧的类胡萝卜素具有较强的极性，所以正己烷的洗脱能力较弱，不能很好地将含氧类胡萝卜素从硅胶柱上洗脱下来。综合考虑，合适的洗脱剂为正己烷∶丙酮= 1∶5 混合液，此时纯化倍数为1.15 倍。

2.1.3 柱填料种类对纯化倍数的影响

部分柱填料种类对纯化倍数的影响见图3。

由图3可知，使用中性氧化铝∶硅胶（100～200目） =2∶1 的纯化效果比单独使用这2 种柱填料的效果要好，中性氧化铝柱效果最差。200～300 目硅胶的目数更高，吸附力更强，预测应当有更高的纯化倍数。但在试验的时候由于洗脱速度比100～200 目硅胶更慢，考虑到试验进程，选择了在层析柱顶部增加适当压力加快洗脱速度，于是在同样的洗脱剂条件下分离效果受到影响，纯化倍数低于100～200 目硅胶。中性氧化铝层析柱的洗脱速度则比100～200 目硅胶更快，样液在柱中容易发生扩散，所以分离效果较差，试验条件下几乎没有纯化作用。

综合考虑试验过程中观察到的分离现象和计算出的纯化倍数，试验筛选出的较为合适的柱层析条件为上样量1 mL，以中性氧化铝∶硅胶（100～200 目） =2∶1 （m/m） 为柱填料，丙酮∶正己烷= 5∶1 为洗脱剂。在此条件下对枸杞类胡萝卜素粗提液进行柱层析，纯化倍数可达1.15 倍，纯化后的类胡萝卜素含量为610.48 μg/g。

2.2 体外抗氧化活性评价

2.2.1 清除DPPH 自由基能力评价

枸杞类胡萝卜素和维C 对DPPH 自由基清除率的比较见图4。

图4 枸杞类胡萝卜素和维C 对DPPH 自由基清除率的比较

由图4 可知，在1～50 μg/mL 质量浓度内，随着质量浓度的增加，维C 对DPPH 自由基的清除率增加，并在5 μg/mL 之后增加趋势变缓，枸杞类胡萝卜素对DPPH 自由基的清除率虽然也在增加，但增加缓慢且清除率与维C 差距较大，质量浓度最大的50 μg/mL 组清除率只有13.9%。可以看出，枸杞类胡萝卜素虽然具有清除DPPH 自由基的能力，但在试验质量浓度下表现不强。

溶液质量浓度和DPPH 自由基清除率的统计学分析结果见表1。

表1 溶液质量浓度和DPPH 自由基清除率的统计学分析结果

DPPH 自由基的半清除质量浓度分别是维C 的IC50=4.98 μg/mL，枸杞类胡萝卜素的IC50=96.53 μg/mL。由表1 的SPSS 统计分析结果可知，皮尔逊拟合优度显著性p 值都大于0.05，说明2 个模型都能很好的拟合试验数据，得出的IC50值有95%置信度。通过比较2 种溶液的IC50值，可认为维C 对DPPH 自由基的半清除能力是枸杞类胡萝卜素的19.38 倍。

2.2.2 清除羟自由基能力评价

枸杞类胡萝卜素和维C 对羟自由基清除率的比较见图5。

由图5 可知，仅在试验设置的最低质量浓度1 μg/mL 组，维C 和枸杞类胡萝卜素具有近似的清除率，之后维C 的清除率大幅上升，在40 μg/mL 之后已能将试验条件下产生的羟自由基全部清除。而枸杞类胡萝卜素的清除能力虽然随质量浓度增加呈线性增加，但增加的幅度很小，质量浓度最大的50 μg/mL组清除率只有39.7%。

溶液质量浓度和羟自由基清除率的统计学分析结果见表2。

表2 溶液质量浓度和羟自由基清除率的统计学分析结果

维C 的IC50=11.60 μg/mL，枸杞类胡萝卜素的IC50=71.32 μg/mL。表2 是对质量浓度和羟自由基清除率进行概率回归拟合度的卡方检验结果。可以看出，2 个模型的皮尔逊拟合优度显著性p 值均大于0.05，说明模型和试验值的拟合度较好，拟合出的IC50具有95%的置信度。比较2 个IC50值，可认为维C 的对羟自由基的半清除能力是枸杞类胡萝卜素的6.15 倍。

通过半数清除率的比较，枸杞类胡萝卜素清除羟自由基的能力强于清除DPPH 自由基，这种差异可能是由于2 种抗氧化试验方法的原理不同造成。对枸杞类胡萝卜素溶液浓度和清除DPPH 自由基、羟自由基活性进行相关性分析。

不同枸杞类胡萝卜素质量浓度与抗氧化活性相关性分析（n=7） 见表3。

表3 不同枸杞类胡萝卜素质量浓度与抗氧化活性相关性分析

由表3 可知，枸杞类胡萝卜素质量浓度和DPPH自由基、羟自由基清除率的相关性是显著的正相关且差异很小。这种情况说明枸杞类胡萝卜素的质量浓度大小对DPPH 自由基和羟自由基的清除效果影响显著，质量浓度越大清除率也越高。但是，李洋等人[5]用石油醚提取枸杞果肉中的类胡萝卜素，并用NKA- 12 型大孔树脂纯化得到含量为109.928 0 mg/L的枸杞类胡萝卜素，采用FRAP 法、DPPH 法、清除羟自由基法、ABTS 法均测不到任何体外抗氧化活性。说明在体外试验中，枸杞类胡萝卜素的质量浓度高到一定程度时，便不再和DPPH 自由基、羟自由基清除率具有相关性。

试验中，以DPPH 自由基清除率和羟自由基清除率建立评价体系，纯化后的枸杞类胡萝卜素表现出了一定的体外抗氧化活性，但以维C 作为对照，其体外抗氧化活性不强。由于体内抗氧化机理更为复杂，体外抗氧化活性并不能等同于体内抗氧化活性，所以尽管试验结果显示其体外抗氧化能力较弱，也不能直接否认其在抗氧化产品应用方面的价值。

试验采用的2 种方法都是测定总抗氧化能力，对于枸杞类胡萝卜素中单一组分的抗氧化能力无法评价。因此，枸杞类胡萝卜素的抗氧化活性还需更细致到各个组分、兼顾体内和体外的研究。

3 结论

试验用石油醚∶丙酮= 5∶1 混合溶剂在料液比1∶20，温度45 ℃水浴加热下提取2 h 得到枸杞类胡萝卜素粗提物。用β - 胡萝卜素标准品绘制标准曲线，得线性方程Y=0.169 6X+0.025 8，R2=0.999 1。根据标准曲线得出枸杞类胡萝卜素粗提物中类胡萝卜素含量为529.65 μg/g。

通过上样量、洗脱剂、柱填料3 个单因素的试验设计，选出的较优柱层析条件为上样量1 mL，丙酮∶正己烷= 5∶1 的混合溶剂为洗脱剂，中性氧化铝∶硅胶（100～200 目） = 2∶1 （m/m） 为柱填料。该条件下纯化倍数为1.15，纯化产物类胡萝卜素含量610.48 μg/g。

纯化后的枸杞类胡萝卜素具有一定的清除DPPH自由基和羟自由基的能力，并且清除羟自由基能力要略强于清除DPPH 自由基的能力。经过SPSS 分析得到半数清除质量浓度IC50值分别是96.53 μg/mL 和71.32 μg/mL。其清除力随着质量浓度增加而逐步增强，但与维C 的体外抗氧化能力相比则差距较大，有待做进一步研究。