吲哚菁绿分子荧光影像在原发性肝癌的应用进展

方驰华，曾思略，杨剑

(南方医科大学珠江医院肝胆一科 广东省数字医学临床工程技术研究中心，广东 广州 510282)

原发性肝癌目前在全世界范围系位列第6位常见恶性肿瘤及第4位肿瘤致死病因，我国肝癌发病率、死亡率均居世界前列，使得我国人民群众的健康与生命受到严重威胁[1-2]。根治性手术是肝癌病人首选的治疗方式，但由于存在肿瘤切除不够彻底、微小癌灶漏诊等问题，目前术后5年生存率仅为18%[3]。

近年来，以吲哚菁绿(indocyanine green，ICG)分子荧光影像为代表的分子影像技术已经广泛应用在普通外科的手术中，并为肝癌的外科治疗提供了新的武器[4]。自上世纪50年代被FDA批准进入临床以来，ICG主要被应用于眼底血管造影、肝功能储备检查等方面；2008年日本Aoki教授首次使用ICG荧光导航系统进行解剖性肝切除术，实现肝段染色，成功率达94.3%[5]。目前ICG在肝脏肿瘤的创新应用主要包括微小肝癌侦测、肿瘤边界界定以及联合三维可视化技术实现肝段染色导航解剖性肝切除等方面[6]。国内外各个中心相继开展该项技术为ICG分子荧光影像在肝癌手术应用疗效提供更多的循证医学证据，其实用价值值得进一步讨论及关注。

一、侦测微小肝癌

传统影像学检查对于小于1 cm的微小肝癌的侦测率并不理想，容易漏诊，导致肝癌术后复发率较高。在近红外光照射下，ICG利用本身特性，与血清蛋白结合的大分子化合物对于肿瘤具有高度敏感性，术中病灶仅需200个肿瘤细胞即可显像，可观察到最小1 mm的病灶[7]。Ishizawa于2009年首次报道ICG分子荧光影像在肝切除术中能够实时高灵敏度识别微小癌灶，提高手术的准确性[8]。其原理为ICG在肝脏被肝细胞选择性摄入后，经胆道排泄，当肝细胞癌变或出现肝硬化结节时，一方面ICG可在肝癌组织特异性聚集；另一方面由于正常肝脏组织被破坏、挤压变形，使得对ICG的摄取及排泄均受影响，从而肝癌组织与正常的肝组织在荧光照射下形成光强对比，术中实时显示病灶。一项研究报道显示[9]：28例病人通过术前注射ICG术中新发现微小病灶10个，其中肝细胞肝癌4个(4/10，40.0%)；37例病人术中给药，新发现微小病灶12个，病理回报肝细胞肝癌5个(5/12，41.6%)。笔者团队研究结果显示[10]：ICG分子荧光影像可发现术前CT、MRI等传统影像所未发现的微小癌灶及肝硬化结节。57例病人术中ICG荧光影像比术前CT多发现17个病灶，其中病理证实10个为肝细胞肝癌(10/17，58.8%)，7个为肝硬化结节。可见ICG分子荧光对于原发性肝癌病人术中侦测微小癌灶、卫星灶具有实用价值。对于复发性肝癌再次接受手术病人，术中寻找复发癌灶十分困难，应用ICG分子荧光影像技术能够准确定位癌灶，指导术中再次切除肿瘤。复发癌灶常不局限于一处，ICG荧光能够侦测到CT及钆塞酸二钠(Gd-EOB-DTPA)磁共振增强图像未发现的微小转移灶。与传统的肿瘤侦测手段相比，ICG的应用使得微小癌灶的侦测率上升，有利于降低术后复发率，提高术后生存率。

ICG分子荧光影像对于微小肝癌及卫星病灶的侦测有较高的灵敏度，但由于ICG荧光本身缺陷，具有较高的假阳性率，术中单凭肉眼难以区分癌灶与肝硬化结节等良性病变，建议切除后送快速病理切片明确荧光结节性质，进一步确定或修改手术方案。对于深部病灶，ICG荧光影像侦测深度有限，无法探及肝实质深部结节。在离断肝实质过程中，如发现有可疑结节可行荧光侦测，防止遗漏微小癌灶；肝切除后可再次用ICG荧光侦测肝断面，确保切缘无肿瘤残余，以达到R0标准，实现根治性肝切除。

二、原发性肝癌边界界定

如何在手术中精准、实时显示肿瘤边界是外科医师面临的一个挑战性问题。以往对于肿瘤边界的判断依靠医师的肉眼观察、触诊及术中超声定位，存在一定的误差。ICG分子荧光影像可在活体状态下对生物体内细胞分子水平的病变状态进行定性和定量分析，客观显示肿瘤边界信息，进行肿瘤边界界定，同时实现目标区域肝实质的3D染色及术中实时导航。不同分化程度的肝癌病灶所显示的荧光类型不同，高分化的肝癌组织由于形态结构接近正常肝细胞，表现为全荧光信号；低分化的肝癌细胞由于本身不摄取ICG，但是压迫周围正常的肝脏组织，导致ICG排泄缓慢，从而大多表现为环形荧光；中分化的肝癌所表现的荧光类型介于两者之间，为混合性部分荧光。

在行肝切除术过程中，若切除范围不足，则导致肿瘤残余。无法达到R0切除标准；若切除范围过大，会增加血管损伤概率及导致术后肝衰竭发生。以往观点认为：最为理想的切除范围是切缘至少距离肿瘤1.5～2.0 cm。但是，对于瘤体巨大的复杂性巨块型肝癌病人，需要考虑剩余肝体积以及防止术后肝衰竭，难以满足此要求[11]。ICG具有良好的肿瘤边界界定能力，术中根据荧光所显示肿瘤边界进行切除，结合快速冰冻病理检查，在切缘阴性前提下，保留更多残肝组织，为巨块型肝癌病人提高手术安全性，降低术后复发。Nishino等[12]应用ICG开发一个新型医学图像投射系统(medical imaging projection system，MIPS)用于实时导航肝切除术；23例病人中有21例可清晰显示边界线，MIPS有望作为一种新型的肝切除实时导航系统用于肝切除过程中的解剖边界界定。有Meta分析报道，ICG分子荧光影像在肝脏肿瘤精准诊疗的应用，可有效界定肿瘤边界，提高切缘的阴性率[13]。

三、确定左右半肝界线

1888年，Rex通过研究肝脏分叶与门静脉分支情况，提出以肝镰状韧带将肝脏分为左右叶的不合理性。1897年，James Cantlie通过研究发现，从胆囊底部到下腔静脉的平面切开肝脏，两侧肝脏的重量相近，从而提出了把肝脏分为左右半肝的Cantlie线[14]。但在临床手术实践中，并非所有病人左右半肝分界均为直线，正常解剖学定义的Cantlie线无法很好作为解剖标志用于术中定位左右半肝切除。应用ICG分子荧光影像进行半肝染色时，多数Cantlie线为不规则走向，包括地图状、驼峰状等形态。这对于导航半肝切除具有重要意义，一般肝功能正常病人保留30%肝体积即可确保避免术后出现肝衰竭风险，而对于肝硬化病人则需要保留40%左右的剩余肝体积才能保证围手术期安全。正常肝脏为不规则楔形，肝中叶左右半肝交界部分最为厚实，半肝切除界线稍微偏移可能导致切除过多的肝组织，可谓“差之毫厘，失之千里”。因此，根据ICG荧光染色个体化确定左右半肝界线，更符合实际肝脏解剖，能够实施更为精准的肝切除，尽可能保留更多正常肝组织，降低围手术期肝衰竭风险。而且，与阻断半肝血流、观察肝脏表面缺血线、超声引导下门静脉注射美蓝标记等方法相比，ICG能够避免缺血线显示不清、染色剂易被快速洗脱等问题，对肝脏持久染色，且染色不局限于表面，达到立体染色效果，能在术中较好地显示左右半肝界限，辅助导航手术。

四、结合三维可视化技术实现解剖性、根治性、功能性肝切除

Makuuchi于上世纪提出的解剖性肝切除，目前已被广泛学者认可。解剖性肝切除的理论基础为通过完整切除肿瘤所在门静脉流域，从而切断肿瘤经门静脉流域肝内传播的途径。既往受技术限制无法获得精准肝段界线，因此行解剖性肝切除时多以Couinaud分段作为理论基础。但是，肝脏肿瘤生长位置不定，临床中常发现由于肿瘤对正常肝脏的挤压等使得肝脏内部结构变形，导致实践中根据正常解剖标志进行肝切除术时不准确，正常肝脏被切除过多或者进行肝段切除时残余没有功能的肝脏组织。三维可视化技术根据血流拓扑学理论，即每个独立的肝段有其独立的门静脉供血及肝静脉回流，进行个体化肝分段，在术前精准评估肝段区域，确定肝脏切除平面，从而更好地指导术前规划。术中将ICG通过正染法或反染法进行肝段立体染色，精准导航肝段及半肝切除。该项技术的关键在于术中精准定位目标门静脉分支。王晓颖等[15]报道了超声引导下联合三维可视化行门静脉穿刺，26例病人均穿刺成功，其中22例(84.6%)ICG染色满意，术后无Ⅲ级以上并发症，围手术期无死亡病人，证明了该项技术的安全性及可行性；笔者所在研究团队研发了LHNS手术导航系统(软件著作权号：No. 2018SR840555)，应用增强现实技术将三维图像和ICG荧光影像进行多模图像实时融合用于导航3D腹腔镜肝切除手术，更好地实现肿瘤边界界定、肝切除范围确定和肝内血管导航，预防和减少术中出血，实现了解剖性、功能性和根治性肝切除[16-17]。目前该项技术正在逐步完善及推广应用。

五、ICG相关分子探针研究进展

尽管ICG分子荧光影像技术已经比较成熟并得到广泛应用，但是对于近红外荧光探针的研究从未停止。由于ICG荧光本身的特性，所能侦测的肿瘤较为表浅且没有主动靶向性，现有研究通过借助不同分子探针，联合磁共振、光学、核素和超声等影像学技术实现对细胞的非侵入式显像，同时通过主动靶向实现术中精准的近红外荧光手术导航。针对肝癌的特异性靶向关键分子，将ICG分子染料结合其他材料制作特异性多模纳米分子探针，注入肝癌动物模型，可以特异性与肝癌细胞表面关键分子受体相结合，利用光声成像技术，实现功能可视化，并且有助于实现诊疗一体化[18-20]，目前正逐步从动物实验研究转化为临床诊疗。

六、ICG近红外二区荧光的研究进展

临床上目前所应用大部分为近红外一区荧光。与常规的近红外一区荧光成像(波长400～900 nm)相比，近红外二区荧光成像(波长1 000～1 700 nm)具有更高的信噪比、更好的组织穿透力和分辨率的特性，能够实现提高对微小癌灶及转移灶的侦测率，在肝癌诊断及术中导航肝切除中具有巨大的应用潜力。以往传统的影像如CT、MRI、PET-CT等对于微小癌灶的侦测率不高，且无法术中进行导航识别毫米级肝癌病灶及转移灶。Hu等[21]的研究报道通过开发一种集成可见光和NIR-Ⅰ/Ⅱ多光谱成像仪,可在不同的光学窗口下进行动物及人体研究，并首次在临床中实现ICG近红外二区手术导航，建立了具有更高空间和时间分辨率的术中实时诊断技术，实现更为彻底的微小癌灶清除，改善肝癌病人的手术疗效及远期预后。相信随着ICG近红外二区荧光技术的逐渐成熟及发展应用，将会使更多的肿瘤病人从中获益，接受更为彻底根治性手术和取得更好的预后。

七、展望

ICG分子荧光影像技术作为数字智能化体系的重要组成部分之一，实现了对肝脏肿瘤的精确边界界定、微小癌灶侦测以及实时导航肝切除等。相信随着ICG分子荧光影像技术的发展，必将为肝脏肿瘤的外科诊疗提供新的思路，推动数字智能化体系在临床更为广泛的应用，造福更多病人。