GC-MS结合保留指数分析轮钟花根的挥发性成分*

王建霞，刘一涵，田云刚，郭洪伟，李 明，毕绍文，魏 华,3

(1.吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南 吉首 416000；2.曲靖市沾益区万远中药材种植农民专业合作社，云南 曲靖 655000；3.湖南省土家医药研究中心，湖南 吉首 416000)

轮钟花(Cyclocodonlancifolius(Roxburgh)Kurz)系桔梗科(Campanulaceae)轮钟花属(Cyclocodon)多年生草本植物，主要分布于东南亚和我国的云南(东南部)、四川、贵州、湖南(西部和南部)，根可入药，无毒，甘而微苦，有益气补虚、祛瘀止痛之效[1-2].《中华本草》记载其有“治疗劳倦气虚乏力、跌打损伤、肠绞痛”等效用[3].轮钟花为湖南湘西及贵州少数民族传统药用植物，其胡萝卜状肉质根，具良好的滋补效果；其紫黑色浆果可食用，富含原花青素、果胶和多糖，具有较强的抗氧化作用[4-5].有研究表明，轮钟花果实中主要含糖类、生物碱、黄酮、酚类、甾体、蒽醌类、三萜类和有机酸等化学成分[6]，但未见根的化学成分研究报道，也未见根的挥发性成分研究报道.基于此，笔者拟采用水蒸气蒸馏法、索氏提取法及超声辅助萃取法分别提取轮钟花药用部位——根的挥发性成分，利用GC-MS技术，并结合保留指数(Retention Index, RI)法对挥发性成分的种类进行定性分析，以期为轮钟花根的深度开发利用提供参考.

1 实验材料

仪器：岛津GCMS-QP2010(日本岛津公司)；步琪Rotavapor R-210旋转蒸发仪(瑞士步琪公司)；中药材粉粹机(永康市铂欧五金制品有限公司)；梅特勒-托利多LE204E分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；昆山舒美KQ-250DE超声仪(昆山市超声仪器有限公司)；KDM型调温电热套(山东鄄城光明仪器有限公司).

试剂：正构烷烃混合对照品C7-C40(产品编号CDAA-M-690038-HC-1 mL，上海安谱实验科技股份有限公司)；正己烷、石油醚(沸程30～60 ℃)、石油醚(沸程60～90 ℃)(天津市富宇精细化工有限公司)；无水硫酸钠(天津市科密欧化学试剂有限公司).以上试剂均为分析纯.蒸馏水.

待测物：轮钟花于2018年12月采自云南省曲靖市沾益区炎方乡小古山村，由毕邵文先生提供，经吉首大学张代贵教授鉴定为桔梗科轮钟花属植物轮钟花的根，凭证标本(JIU. WU20181201)存于吉首大学“湖南省土家医药研究中心”.将待测材料于45 ℃烘箱烘干，粉碎，过2号筛备用.

2 提取方法

2.1 水蒸气蒸馏法

准确称量轮钟花根粉末10 g置于1 000 mL 圆底蒸馏瓶中，加入300 mL蒸馏水和玻璃珠数粒，隔夜浸泡.连续提取8 h至挥发油量不再增加后，收集馏液，置于分液漏斗中，使用正己烷萃取3次.萃取液加适量无水硫酸钠脱水后，40 ℃减压浓缩，即得.

2.2 索氏提取法

准确称量轮钟花根粉末10 g置于滤纸筒，包实放入索氏提取管中.提取管上接冷凝管，下接装有100 mL石油醚(沸程30～60 ℃)的250 mL三角瓶.置于40 ℃水浴锅回流提取4 h，然后将三角瓶中收集的提取液40 ℃减压浓缩，即得.

2.3 超声辅助萃取法

准确称量轮钟花根粉末10 g置于250 mL三角瓶中，按料液比1∶10加入石油醚(沸程60～90 ℃)，于40 ℃超声仪内超声提取2次，每次30 min，超声频率40 kHz，超声功率250 W.完成后抽滤，收集滤液，于40 ℃减压浓缩，即得.

2.4 GC-MS分析条件

色谱条件：SH-Rtx-5MS气相色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，载气为高纯He(纯度大于99.99%)，载气流量1 mL·min-1，进样量1.0 μL，进样口温度250.0 ℃，分流比20∶1.程序升温：初始温度100 ℃，以5 ℃·min-1的速率升温至200 ℃，保持5 min，再以6 ℃·min-1的速率升温至280 ℃，保持20 min，溶剂延迟3 min.质谱条件：EI离子源，电子能量70 eV，质量扫描范围m/z50～600 amu，离子源温度230 ℃.

2.5 保留指数的测定

取正构烷烃混合对照品(C7-C40)0.1 mL溶于1 mL正己烷中，取适量过膜备用，按照前述色谱条件进行分析，记录保留时间，计算各待测化合物的保留指数(RI).

3 结果分析

按上述GC-MS条件测定，三种方法提取轮钟花根挥发性成分的总离子流图(TIC)如图1所示.

1—索氏提取法；2—水蒸气蒸馏法；3—超声辅助萃取法.图1 轮钟花根挥发性成分总离子流图Fig. 1 Total Ion Chromatogram of Volatile Components of Roots in Cyclocodon lancifolius (Roxburgh) Kurz

运用单一线性升温公式[7]计算待测组分的RI值，并与美国国家标准与技术研究院(NIST)化学数据库(http:∥webbook.nist.gov/chemistry/)和NIST14s.lib标准谱库中RI文献值进行对比，以保留指数接近且质谱图相似度较高组分为鉴定结果，采用峰面积归一化法计算各组分的质量分数，结果列于表1.

表1 轮钟花根挥发性成分

表1(续)

由表1可知：轮钟花根的挥发性成分共确定76种化合物，其中水蒸气蒸馏法、索氏提取法和超声辅助萃取法各确定24，45，39种化合物，分别占所提取挥发性成分的87.04%，95.06%，98.98%. 三种提取方法检测出的相同成分仅3种，分别为棕榈酸、亚油酸以及正二十九烷.

由表1还可以看出：水蒸气蒸馏提取物挥发性组分中质量分数在3%以上的有7种，总质量分数达64.21%.其中，亚油酸质量分数最高(22.67%)，其次为Butyl 9,12,15-octadecatrienoate(15.88%)、丙烯酸-2,3-环氧丙酯十八烯酸(6.22%)、棕榈酸(6.13%)、反油酸(5.33%)、Tricyclo[20.8.0.0(7,16)]triacontane, 1(22),7(16)-diepoxy(4.88%)、1-iodo-triacontane (3.1%).索氏提取物挥发性组分中质量分数在3%以上的有7种，总质量分数达48.86%.其中，亚油酸质量分数最高(18.25%)，其次为棕榈酸(9.92%)、角鲨烯(5.86%)、油酸(4.7%)、三十一烷(3.48%)、维生素E(3.4%)、二十五烷(3.25%).超声提取物挥发性组分中质量分数在3%以上的有9种，总质量分数达78.98%.其中，亚油酸质量分数最高(21.6%)，其次为植物甾醇(19.81%)、棕榈酸(11.88%)、反油酸(6.42%)、维生素E(4.74%)、硬脂酸(4.43%)、亚油酸乙酯(3.47%)、环阿屯醇(3.41%)、二十酸(3.2%).由此可见，轮钟花根的挥发性成分以酸类、烃类、酯类和醇类为主.

4 结语

笔者采用水蒸气蒸馏法、索氏提取法和超声辅助萃取法提取了轮钟花根挥发性成分，因三种方法提取原理不一样，所提取的挥发性成分种类及其质量分数有一定的差异.水蒸气蒸馏法操作简单、成本低，超声辅助萃取法提取时间短，能够避免对热不稳定成分的破坏[8].在轮钟花根的挥发性成分中，索氏法提取的种类最多，水蒸气法提取的种类最少.同时利用三种方法提取轮钟花根挥发性成分，并结合保留指数进行定性分析，可以得到更全面和更准确结果.

在三种方法的提取物中，酸类化合物亚油酸的质量分数都是最高的.亚油酸作为人体必需的脂肪酸和重要的多不饱和脂肪酸，日常需求极高，具有抗粥状动脉硬化和增强肌体免疫能力等作用[9].同时，挥发性成分中还含有大量的植物甾醇，在超声法提取物中，植物甾醇质量分数就达19.81%.植物甾醇是一种天然甾体化合物，是植物细胞膜的重要组成部分，在植物油中分布较多，具有降低胆固醇、抗炎、抗肿瘤等多种药理作用[10-11].另一重要成分二十八烷醇，被认为是一种天然的高级醇，具有抗疲劳、促进新陈代谢和抗炎等多种生理功能[12-14].这都充分说明，轮钟花作为传统的药用植物，具有不可忽视的新药开发价值.近年来，人们对轮钟花的开发利用日益重视，云南曲靖、湖南保靖等地已开始人工种植，以其果实销售于市场，其根产量也必然会有所增加，测定根中的挥发性成分，对阐释其药效物质和资源的综合开发具有重要现实意义.