海南岛索氏桃花水母的遗传学鉴定

刘明中，张清凤，申志新，董 杨，王 吉，赵荣科

(海南热带海洋学院 a.海南省海洋与渔业科学院淡水渔业研究所；b.海南现代海洋牧场工程研究中心； c.生态环境学院，海南 三亚 572022)

0 引言

索氏桃花水母是一种淡水水母，水母体直径约20～25 mm。目前，人们已经陆续在除南极洲外的世界各地发现了索氏桃花水母，尤其是在亚热带到温带地区[1]。索氏桃花水母不仅能够存在于水族馆、池塘和水库等人工水体中[2-4]，也可在天然淡水生境，例如小溪、湖泊和河流中生存[5-6]。索氏桃花水母主要生活在中营养到富营养化环境[7]。通常，人们很难判断这些水母是从其他地方新引入的，还是长期存在于当地，而只是新近才被发现的，抑或是原有种近期发生了大规模的扩散[8]。

中国作为桃花水母分布最广泛的国家之一[9-10]，从20世纪80年代起开始在全国19个省均有发现淡水水母的报告，共记录了18个新物种[11]。然而，Fritz等[8]分析了中国和其他地区的桃花水母的COX1和ITS基因序列，认为这些“新物种”中的绝大多数都是索氏桃花水母。因此，包括Craspedacustakiatingi，Craspedacustachuxiogensis，Craspedacustakawaii，Craspedacustakuoi，Craspedacustasichuanensis和Craspedacustaziguiensis在内的“新物种”，都是索氏桃花水母的不同地理群体。

然而，我国此前未曾有过任何在离岸岛屿的淡水中发现索氏桃花水母的报道，而关于索氏桃花水母的扩散途径也尚不完全明确。海南岛不仅是中国第二大岛屿，更是中国完全处于热带的最大岛屿，丰富的热带雨林资源造就了岛上发达的淡水生态系统[12]。由于与欧亚大陆隔有琼州海峡，海南岛上包括人类在内的各类生物与欧亚大陆上的生物学分化与交流问题一直是研究热点[13]。本研究就所查文献，也未见国内在海岛上发现索氏桃花水母的报道。

1 材料与方法

1.1 采样地点

大王岭水库位于海南岛的儋州市兰洋镇，地理坐标109°42′ E，19°28′ N，建于1975年，主要用于农业灌溉和水产养殖，集水面积2.8 km2，库容量3.87×106m3。

在2019年11月，课题组在海南儋州市大王岭水库发现有淡水水母并进行取样和现场拍照(图1)，取样后的水母个体保存在无水乙醇中。

图1 海南儋州大王岭水库淡水水母照片

1.2 实验方法

1.2.1 样品采集与DNA提取

样品从大王岭水库中采得后保存于无水乙醇中，4 ℃保存。DNA的提取采用天根海洋动物基因组试剂盒(https://www.tiangen.com/?productShow/t1/1/id/23.html)，提取后的DNA放于-20 ℃以备聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。

1.2.2 样品COX1基因和ITS基因的序列扩增与鉴定

COX1基因序列扩增使用的引物采用COX1通用引物[14]，正向引物COX1F1：5′-TCAACCACCCACAAAGACATTGGCAC-3′，反向引物COX1R1：5′-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3′。

COX1基因的PCR反应总体系为50 μL，包括Taq酶，Mix缓冲液20 μL，10 μmol浓度的上下游引物各2 μL，模板DNA 1 μL，浓度10 ng，无菌ddH2O补充至50 μL。扩增条件：94 ℃变性5 min，1个循环；94 ℃变性40 s，45 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，最后将扩增产物4 ℃保存。

ITS基因序列扩增使用的引物根据邹秀[15]设计的引物序列合成，正向引物ITSF1：5′-GTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3′；反向引物ITSR1：5′-GGTAGTCTTGCCTGATCTGAGG-3′；PCR反应为50 μL体系，包括Taq酶Mix缓冲液20 μL，10 μmol浓度的上下游引物各2 μL，模板DNA 1 μL，浓度10 ng，无菌ddH2O补充至50 μL。ITS基因的序列PCR扩增条件为：94 ℃变性4 min，1个循环；94 ℃变性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

反应产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送青岛华大基因公司测序。经过双向测序获得的原始数据通过Contigexpress软件校正拼接后，导出的序列与GenBank数据库中收录的桃花水母COX1基因和ITS基因进行序列相似性比对；利用MEGA 5.0软件计算序列间的相对遗传距离，构建邻接系统树(Neighbor-joining tree)。系统树各分支的置信度由Bootstrap 1000次循环检验。

2 结果与分析

2.1 采样地点环境特征

取样时大王岭水环境参数如表1所示。

表1 海南儋州大王岭水库采样时水环境参数

本研究采样时间为2019年11月。按照湖泊(水库)营养状态评分法评价标准[16]，从水环境参数上可知采样时大王岭水库处于中营养化状态，尤其是叶绿素a浓度、总氮浓度和总磷浓度3个指标，其中总氮浓度相对较高。但由于水库有外源流水注入且取样时水温不高的原因，因此水体溶氧较高，浊度较低。总体上库区水环境基本健康。

2.2 儋州桃花水母COX1与ITS基因序列分析

通过对儋州桃花水母COX1基因和ITS基因序列进行PCR扩增，分别获得了600 bp长的COX1基因序列和701 bp长的ITS基因序列。测序获得了样品COX1(GenBank序列号：MT884060.1)和ITS(GenBank序列号：MT737784)序列，利用NCBI数据库中的Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)与GenBank中收录的桃花水母COX1基因和ITS基因进行序列相似性比对(表2、表3)，儋州的桃花水母与已知的索式桃花水母COX1基因序列(LN901194.1)相似度达99.66%，ITS基因序列与已知的索式桃花水母ITS基因序列(AY513628.1，AY513626.1)相似度达100%，综合表明，海南儋州发现的淡水水母为索式桃花水母。

表2 基于COX1基因建立的不同地区索氏桃花水母的遗传距离

表3 基于ITS基因建立的不同地区索氏桃花水母的遗传距离

对样品与其他索氏桃花水母进行基于COX1基因的遗传距离计算与进化树构建(图2)发现，海南儋州的索氏桃花水母与其他索式桃花水母的遗传距离保持在0.002～0.188之间。邻接进化树显示海南索氏桃花水母与美国索氏桃花水母聚为一支。

图2 邻接法构建的海南儋州与其他地区索氏桃花水母的COX1区系统发育树

对样品与其他索氏桃花水母进行基于ITS基因的遗传距离计算与进化树构建(图3)发现，海南儋州的索氏桃花水母与其他索式桃花水母的遗传距离保持在0.000～0.403之间。邻接进化树显示在ITS基因上海南索氏桃花水母与湖北索氏桃花水母聚为一支。

图3 邻接法构建的海南儋州与其他地区索氏桃花水母的ITS区系统发育树

3 讨论

3.1 索氏桃花水母的分子鉴定

部分研究对野外发现的索氏桃花水母进行了形态学鉴定，但总体上各地索氏桃花水母的形态学特征，例如触手数、伞径等参数并不完全一致[15,17-18]，因此仅仅依靠形态鉴定的手段对桃花水母定种，存在一定的局限性。现在已有越来越多研究通过分子生物学手段来进行定种。对桃花水母的分子生物学鉴定，除了进行基本的单个基因或基因组的序列测定之外，许多研究还对现有的各个桃花水母发现报道中发表的DNA序列进行了系统进化分析。陶莎等[19]对采得水母样品进行COX1区、18S区和ITS区测序，首先将测得序列与GenBank上的已有序列进行多序列比对，确定了采得的贵州福泉水母样品为索氏桃花水母。此外，该研究还将样本序列用来与这些GenBank上的索氏桃花水母序列进行了基于邻接法的系统进化树构建，发现采用不同单个基因构建的进化树，得到与该样品聚类关系最近的索氏桃花水母样品均有所不同；Hroudova等[20]对索氏桃花水母进行了转录组注释，在Craspedacustasowerbyi的转录组中确定了6个同源异形结构域基因(Homeodomain)，这些基因主要在平衡囊、柄状突起和神经环等具有感觉和神经活动的结构组织中表达，表明水螅水母的转录组中普遍含有丰富的同源结构域转录基因，用于调节感觉和神经功能；Fuentes等[21]193对4个智利的湖泊中的淡水水母样品进行了COX1基因测序并确定为索氏桃花水母，并对各样品之间、以及与其他发表的索氏桃花水母COX1基因序列进行了进化树构建，初步阐明了智利样品与其他地区样品之间的进化关系；而Zou等[22]则对发现自武汉的索氏桃花水母进行了线粒体基因组测序，并对序列进行了基因注释，包括基因识别和基因结构注释等，并构建了索氏桃花水母和其他已发表的腔肠动物线粒体基因组的系统进化树，发现与索氏桃花水母在线粒体基因组的遗传进化上最近的物种是CubaiaAphrodite。Schifani等[23]报道了索氏桃花水母在意大利西西里岛的发现，并对样品进行了线粒体COX1基因和核ITS基因的测序，并与其他索氏桃花水母的序列进行了进化树构建，确定了西西里岛的样品与世界其他样品的遗传学关系。类似的工作还有Fritz等[8]对在德国采得的桃花水母进行的COX1基因和ITS基因测序，并将其与中国的Craspedacustasowerbyi和Craspedacustakiatingi样品进行序列比较和进化树构建，发现2个地方的桃花水母虽然形态结构不同，但序列相似度较高，并提出支持现有的4种桃花水母有效种分别为Craspedacustasinensis,Craspedacustasowerbyi，Craspedacustakiatingi和Craspedacustaziguiensis这一假说；此外，Karaouzas等[24]对在希腊一条人工运河中发现的索氏桃花水母进行了COX1基因序列测定，并构建了其与中国湖北(NC018537)和德国个体的系统进化树，发现与湖北个体进化关系较近。

综上所述，大部分研究者对于当地发现的桃花水母，其关注点都集中在与其他地方个体之间的亲缘关系。另外，对同一个体采用不同的单个基因构建进化树时，得到的与其他个体的亲缘关系不尽相同。这一现象同样发生在本研究的海南儋州的索氏桃花水母上。本研究认为，对索氏桃花水母的遗传进化与系统发育分析有赖于进一步对各地个体进行全基因组的序列测定和注释，再以此探究各地桃花水母之间的亲缘关系，能够有效克服单个基因代表性有限的问题。

3.2 索氏桃花水母的环境适应性与生物入侵

有部分研究将索氏桃花水母定义为一个全球性入侵物种[7,9,23-26]。另据文献记载，虽然索氏桃花水母的首次发现是在伦敦[27]，但这一物种通常被认为起源于中国[28]。对于海南岛的索氏桃花水母是本地物种还是外来种，尚有待进一步研究。此外，索氏桃花水母偏好富营养化到中营养化的淡水环境[7]，对水温有着宽广的适应幅度[21]193，这样的特点与本研究中大王岭水库的环境特征相近。然而也有研究表明索氏桃花水母对紫外线的耐受性非常有限[21]199，但海南岛属于光照充足的低纬度热带岛屿。因此，大王岭水库中的索氏桃花水母的紫外线耐受性是否存在特异性，有待进一步研究。此外，海南岛由于其淡水生态系统的独立性，有大量丰富的本土物种，大王岭水库则拥有海南长臀鮠(Cranoglanismultiradiatus)，子陵吻鰕虎鱼(Rhinogobiusgiurinus)，海南似鱎(Toxabramishoudemeri)等本土物种，索氏桃花水母的存在是否会对这些物种产生影响，也值得进一步研究。

(责任编辑：白净)