缬草酸对癫痫小鼠神经元保护及P-糖蛋白表达的影响

于忠娟，柴 峰，时宝林，张跃其，吴春丽

(1.山东省潍坊市第六人民医院内科，山东 潍坊 261000； 2.山东省潍坊市人民医院神经内科，山东 潍坊 261000； 3.山东省潍坊市人民医院产一科， 山东 潍坊 261000)

癫痫是一种常见的神经系统疾病，由脑神经元异常放电引起的大脑短暂功能障碍。全球约有7000万癫患者，我国的癫痫发病率约30/10万/年左右，患病率为4‰～7‰[1]，并有30%的癫痫患者无法通过抗癫痫药物(anti-epileptic drug，AED)得到有效控制，进一步发展成为难治性癫痫或者顽固性癫痫[2]，给家庭和社会带来了沉重的负担，迫切需要寻找到新的癫痫疗法和药物。P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-GP)是一种跨膜蛋白，与药物的细胞内积累相关，研究表明其在癫痫患者大脑中过度表达并增加药物排出，介导机体对AED的耐药性[3]。

最近研究发现缬草根提取物(主要为缬草酸)不仅有效治疗焦虑、失眠，还具有抗惊厥作用，增强了抗癫痫药物的作用效果[4]，服用缬草根的癫痫患者会出现更好的治疗效果，提示缬草酸具有潜在的神经元保护作用[5]。目前少有关于缬草酸的基础研究，尚不明确缬草酸针对癫痫影响的作用机制。本研究拟明确缬草酸联合丙戊酸钠(sodium valproate，VPA)对戊四唑(Pentylenetetrazole，PTZ)诱导癫痫小鼠的神经元保护作用及对P-GP表达影响，从而为难治性癫痫的治疗提供一种新有效手段。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SFP级6～8周健康雄性KM小鼠，共60只，购自山东大学实验动物中心[SCXK(鲁) 2019-0001]，体重(19.5±2.4)g，小鼠饲养于潍坊医学院动物房中[SYXK(鲁)2019-0016]，饲养温度为18℃～20℃。环境安静、清洁，模拟自然昼夜。本实验经潍坊市第六人民医院实验动物伦理审查委员会审查(R0821050)。实验过程按照《实验动物管理与使用指南》进行，严格遵守动物使用3R原则，整个实验过程均给予实验小鼠以人道主义关怀。

1.2 主要试剂与仪器

缬草酸(加拿大Chromadex公司)；戊四唑(美国Sigma公司)；丙戊酸钠(美国Sigma公司)；P-GP 及Cleaved-caspase-3小鼠一抗(美国Princeton，公司)；β-actin一抗(美国Abcam公司)；Western超敏发光试剂盒(美国Millipore公司)；DAPI封固剂(江苏碧云天公司)；TUNEL原位凋亡检测试剂盒(南京凯基公司)；化学发光成像分析系统(美国UVP公司)，台式冷冻离心机(美国Thermo Fisher公司)，转膜电泳仪(北京六一仪器厂)；石蜡切片机(德国Leica公司)；激光共聚焦显微镜(德国Zeiss公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组

随机分为6组: 正常对照组、模型对照组、VPA组、缬草酸+VPA组(低中高剂量各一组)，每组10只。

1.3.2 给药

除正常对照组外，每组均于第1天、第3天、第5天、第8天、第10天及第12天进行1次PTZ腹腔注射(30 mg/kg)制备癫痫模型[6]，第12天腹腔注射后1 h连续观察各组癫痫发作的等级、持续时间及潜伏时间。正常对照组按照PTZ给药时段给予生理盐水1 mL腹腔注射；VPA组及缬草酸+VPA组均灌胃给予VPA(30 mg/kg)，连续给药12 d。在给药VPA灌胃的同时，低、中、高剂量缬草酸+VPA组分别给予60、120和180 mg/kg缬草酸灌胃。

1.3.3 癫痫发作等级评分

以Racine评分评判小鼠癫痫发作等级[7]，标准如下：0级：正常奔跑，无非应激性反应；1级：面部肌肉抽搐、颤动；2级：1级发作伴节律性点头或前肢肌阵挛；3级：2级发作伴有前肢抽搐，无后肢痉挛、直立；4级：3级发作伴有后肢阵挛，或有摔倒、后肢直立；5级：全身性强直、后肢强直性延伸、癫痫持续状态或死亡。

1.3.4 组织标本采集

在进行末次行为学评估30 min后将各组取脑组织标本，进行蛋白定量或甲醛组织固定。断头处死后，刨开颅脑，小心取出小鼠大脑，将其迅速放在冰上，眼科镊剥离一侧大脑半球皮层组织，放入液氮中保存，以备蛋白定量实验。同时将另一侧未分离大脑组织置于4%多聚甲醛固定，以备Tunel染色。

1.3.5 Western blot

为明确缬草酸是否能影响癫痫小鼠中P-GP及caspase-3活性片段，取新鲜皮层组织后进行Western blot检测。脑组织中加入裂解液(1 mL/mg)，匀浆后在4℃下离心10 min。在样品中加入2×上样缓冲液，煮沸5 min。每孔上样量100 μg。十二烷基磺基聚丙烯酰胺钠凝胶电泳(30 mA)分离蛋白质，Marker接近胶底板时停止电泳。转移至PVDF膜，持续40 min，5%脱脂牛奶封闭，室温匀摇2 h，将膜于P-GP一抗(1∶500)或Cleaved-caspase-3(1∶1000)4℃孵育过夜，37℃水浴中于HRP标记二抗(1∶2000)孵育1 h，漂洗后加如ECL发光试剂。使用化学发光分析仪拍照，用Image-J软件进行半定量分析。

1.3.6 Tunel染色

将各组小鼠脑组织进行Tunel染色，以观察神经元凋亡率。将冷冻切片浸入盛有4%多聚甲醛固定液的染色缸，固定20 min，浸入1×PBS 漂洗三次(每次5 min)；样本片浸入通透液中，室温促渗5 min，漂洗3次，每个样本上滴加50 μL TdT 酶反应液，放入温盒中避光反应60 min，漂洗3次，每个样本上滴加50 μL Streptavidin-TRITC 标记液，37℃避光反应30 min。漂洗后DAPI 固封剂封片，室温避光反应10 min，上共聚焦显微镜观察。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 各组行为学表现

各组发作潜伏期及持续时间见表1。相较模型对照组，VPA组及不同剂量缬草酸+VPA组发作持续时间缩短，潜伏时间延长(P值均<0.001)。与VPA组比较，不同剂量缬草酸+VPA组发作持续时间缩短(P值均<0.001)，中剂量缬草酸+VPA组发作潜伏期延长(P=0.029)。进一步分析各组小鼠发作等级(图1)，VPA组癫痫发作级别较模型对照组明显下降(P<0.001)，而中剂量及高剂量缬草酸+VPA组癫痫发作级别较VPA组下降(P分别为<0.001、0.019)。以上结果表明，中剂量及高剂量缬草酸可降低癫痫模型小鼠的发展等级，且中剂量组改善更明显。

2.2 大脑皮质P-GP及Cleaved-caspase-3蛋白表达

癫痫发作72 h后，模型对照组大脑皮质P-GP明显高于正常对照组(P<0.001)，VPA组P-GP蛋白表达较模型对照组无明显改变(P>0.05)，缬草酸低、中、高剂量组P-GP蛋白较VPA组下降(P分别为0.02、<0.001、<0.001)，见图2、3。Cleaved-caspase-3(17kD)是caspase-3剪切后的活化形式，我们检测了各组小鼠大脑皮质cleaved-caspase-3表达。模型对照组Cleaved-caspase-3明显高于正常对照组(P<0. 001)，VPA组表达较模型对照组明显改变(P=0.004)，缬草酸中剂量组表达较VPA组下降(P=0.014)，见图2、4。以上结果表明，相较于VPA治疗，VPA联合不同剂量缬草酸能有效降低癫痫模型小鼠大脑皮质中P-GP蛋白表达，而VPA联合中剂量缬草酸能减少Cleaved-caspase-3表达。

2.3 大脑皮质细胞凋亡情况

本研究随后检测了各组小鼠大脑皮质神经元凋亡情况。模型对照组神经元凋亡较正常对照组明显升高(P<0. 001)，VPA组凋亡率较模型对照组明显降低(P<0.001)，缬草酸低、中、高剂量组凋亡率较VPA组下降(P分别为0.028、<0.001、<0.001)，见图5、6。以上结果表明，相较于VPA治疗，VPA联合中剂量缬草酸能显著降低癫痫模型小鼠神经元凋亡率。

3 讨论

目前AED有10余种，有1/3的患者无法通过AED得到有效的治疗，进一步发展成为难治性癫痫或者顽固性癫痫[8]，AED的耐药机制是癫痫治疗过程中的关键，耐药过程涉及多种不同的细胞机制[9-10]。研究发现，AED治疗可促进多药耐药相关蛋白1基因(MRP1)及其蛋白产物P-GP的过度表达[11]，P-GP可以将抗癫痫药泵回外周循环，这种再循环可能会降低大脑药物浓度，从而导致耐药性难治性癫痫和抗癫痫药治疗效果降低[12]。此外许多抗癫痫药是P-GP的底物，癫痫发作本身可能会增加P-GP的表达[13]。已经有研究证实部分药物(如氟桂嗪、环氧合酶2等)能有效下调P-GP的表达，在难治性癫痫中具有潜在作用[14-15]。

表1 各组小鼠癫痫发作情况Table 1 Seizures of mice in each group

注：与模型对照组比较，***P<0.001；与VPA组比较，##P<0.001；与VPA组比较，#P<0.05。图1 各组癫痫发作等级Note. Compared with model control group,***P<0.001. Compared with VPA group, ##P<0.001. Compared with VPA group,#P<0.05.Figure 1 Seizurelevel of each group

注：A：正常对照组；B：模型对照组；C：VPA组；D：低剂量缬草酸+ VPA组；E：中剂量缬草酸+ VPA组；F：高剂量缬草酸+ VPA组。图2 Western blot检测各组小鼠P-GP及 Cleaved-caspase-3蛋白表达Note. A, Normal control group. B, Model control group. C, VPA group. D, Low dose valeric acid +VAP group. E, Medium dose valeric acid + VPA group. F, High dose valeric acid +VPA group.Figure 2 Representative western blot of P-GP and Cleaved-caspase-3 protein in each group

本研究中，缬草酸联合VPA可降低癫痫小鼠发作等级，相较单用VPA效果好，提示缬草酸可增强VPA的抗惊厥作用。缬草酸为缬草提取物中的主要成分，含有不同比例的羟基缬氨酸和乙酰氧基缬氨酸。缬草提取物已用于治疗多种症状，如焦虑症和失眠症，已有超过2000年的历史[17]。目前研究表明，缬草酸具有很强的抗惊厥作用，Torres-Hernndz等[16]发现缬草酸与氯硝西泮及苯妥英钠具有协同相互作用，增强了两者的抗惊厥作用，可延长成年斑马鱼癫痫发作的潜伏期[16]。服用缬草的癫痫患者会有明显的镇静作用，并有更好的抗癫痫治疗效果[4]，而且由于其吸收快、不易蓄积的特性，具有较好的安全性。本研究结果进一步证实了缬草酸的抗惊厥作用，但目前尚无关于缬草酸抗癫痫机制的研究。

丙戊酸钠(VPA)是一种有效的AED，成本相对较低，为癫痫治疗的重要药物。在本研究中，我们将缬草酸与VPA联合使用以观察对PTZ癫痫模型小鼠P-GP水平及癫痫发作的影响。结果表明，缬草酸和VPA共同给药可降低大脑皮层P-GP水平，癫痫发作严重程度显著降低，提示缬草酸可能通过调节P-GP表达而增强VPA的抗惊厥作用。

注：与正常对照组比较，***P<0.001；与VPA组比较，#P<0.001，##P<0.001。A：正常对照组；B：模型对照组；C：VPA组；D：低剂量缬草酸+ VPA组；E：中剂量缬草酸+ VPA组；F：高剂量缬草酸+ VPA组。图3 各组P-GP相对表达量分析Note. Compared with normal control group,***P<0.001.Compared with VPA group,#P<0.05. ##P<0.001. A, Normal control group. B, Model control group. C, VPA group. D, Low dose valeric acid + VPA group. E, Medium dose valeric acid + VPA group. F， High dose valeric acid + VPA group.Figure 3 Analysis of relative expression of P-GP in each group

图5 Tunel检测各组小鼠神经元凋亡Figure 5 Apoptosis examination was performed by Tunel assay

注：与正常对照组比较，***P<0.001；与模型对照组比较，※※P<0.05；与VPA组比较，#P<0.001。A：正常对照组；B：模型对照组；C：VPA组；D：低剂量缬草酸+ VPA组；E：中剂量缬草酸+ VPA组；F：高剂量缬草酸+ VPA组。图4 各组Cleaved-caspase-3相对表达量分析Note. Compared with normal control group,***P<0.001.Compared with model control group group,※※P<0.05. Compared with VPA group,#P<0.001. A, Normal control group. B, Model control group. C, VPA group. D, Low dose valeric acid + VPA group. E, Medium dose valeric acid + VPA group. F, High dose valeric acid + VPA group.Figure 4 Analysis of relative expression of Cleaved-caspase-3 in each group

注：与正常对照组比较，***P<0.001；与模型对照组比较，※※※P<0.05；与VPA组比较，#P<0.001，###P<0.001。A：正常对照组；B：模型对照组；C：VPA组；D：低剂量缬草酸+ VPA组；E：中剂量缬草酸+ VPA组；F：高剂量缬草酸+ VPA组。图6 各组神经元凋亡率分析Note. Compared with normal control group, ***P<0.001.Compared with model control group group, ※※※P<0.05. Compared with VPA group, #P<0.001, ###P<0.001. A, Normal control group. B, Model control group. C, VPA group. D, Low dose valeric acid + VPA group. E, Medium dose valeric acid + VPA group. F, High dose valeric acid + VPA group.Figure 6 Analysis of neuronal apoptosis rate in each group

癫痫发作可导致脑神经元损伤，进而出现神经元凋亡，并引起胶质细胞增生、突触重建等脑结构功能变化[8]，细胞凋亡是一个复杂的生物过程，涉及许多细胞信号通路。Caspase-3是关键的细胞凋亡介体，剪切后的活化形式分子量为17×103的Cleaved-caspase-3[18]，一般是用活性形式说明caspase途径的激活。我们检测了Cleaved-caspase-3的表达以明确缬草酸对脑组织的保护作用。结果表明，缬草酸显着降低了癫痫小鼠大脑中Cleaved-caspase-3的表达，同时，癫痫小鼠的神经元凋亡率也明显降低，提示缬草酸在减轻癫痫发作等级的同时，还存在神经元的保护作用。

总之，本研究表明，缬草酸联合VPA可降低PTZ诱导癫痫小鼠大脑中P-GP的表达并增强VPA的抗惊厥作用。此外，缬草酸还可降低caspase-3活性片段的表达，在癫痫治疗过程中对大脑起到潜在保护作用。缬草酸与VPA联合治疗癫痫可能是一种有效且耐受性良好的治疗方案，而缬草酸如何调控P-GP、凋亡因子及其信号通路机制尚未清楚，有待进一步深入研究。