血常规和血生化指标在患强直性脊柱炎食蟹猴中的临床价值

李玉莹，麦冬梅，贾欢欢，吴志恒，何刚华，唐爽捷，马承红，卢 丽*

(1.广东药科大学，广州 511400； 2.广东省实验动物监测所(广东省实验动物重点实验室)，广州 510663； 3.广州春盛生物研究院有限公司，广州 510900； 4.广东药科大学附属第一医院，广州 510000)

强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一种病因未明的自身免疫性疾病，主要累及骶髂及脊柱关节[1]，青少年多发，男性多于女性，随着病情的进展，AS患者的生活质量会受到极大的影响，目前尚无良好的治疗药物和干预措施。

疾病动物模型的构建是研究疾病发生机理和防治策略的基础[2]，随着对强直性脊柱炎病因病机的研究，国内外学者已构建了若干个强直性脊柱炎动物模型[3]，遗憾的是这些模型均为啮齿类动物模型，与AS患者临床表现存在较大差异。非人灵长类动物在遗传背景、生理结构等方面与人类高度相似[4-5]，课题组经过多年研究，建立了一种自发性AS食蟹猴动物模型，将为AS相关药物的安全性和有效性评价起到重要作用。动物外周血血常规、血生化指标的检查，是药物安全性和有效性评价最常用的评价指标，本研究将对AS食蟹猴血常规和血生化指标进行检测和评价，以期寻找到适合AS食蟹猴评价的关键指标，为AS的后续研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物

从约2000只食蟹猴群体中，筛选自发性AS食蟹猴 40 只，雌性 27 只，雄性 13 只，年龄：(10.22±3.00)岁，体重:(4.46±1.93)kg；筛选雌性 25 只，雄性 15 只，年龄：(11.00±3.19)岁，体重:(5.52±1.60)kg。已适应喂养2年。两组动物年龄性别等基本生理参数均衡可比。级别：普通级；动物由广东春盛生物科技发展有限公司提供[SCXK(粤)2019-0027]。已经通过广东省实验动物监测所IACUC的审查(IACUC2018002)，符合“3R”原则。饲养条件：群居饲养于广东春盛生物研究院有限公司[SYXK(粤)2015-0152]，环境温度18℃～26℃，相对湿度 40%～70%，自然采光。

1.2 主要试剂与仪器

血常规：血红细胞分析用稀释液(CELLPACK DFL)、Hb溶血剂 (SULFOLYSER)、WNR 溶 血剂 (Lysercell WNR)、WDF 溶血剂(Lysercell WDF)、WDF 染色液(Fluorocell WDF)、WNR染色液(Fluorocell WNR)、PLT 荧光染色液(Fluorocell PLT) (批号分别为:A7010、A7014、A8006、A7019、A7062、A7047、A7094，日本 Sysmex 株式会社)；血液分析仪XN-1000 V[B1]型(日本 Sysmex 株式会社)。

血生化：白蛋白试剂盒、总蛋白试剂盒、碱性磷酸酶测定试剂盒、总胆固醇试剂盒、甘油三酯试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇试剂盒。试剂均为上海科华生物工程股份有限公司产品；仪器使用3100型全自动生化分析仪(日本日立公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 AS动物选择

通过对动物进行体格检查，并使用测角仪来评估脊柱的曲率和膝关节和髋关节的运动范围(ROM)进行自发性AS动物的初筛[6]，随后进行X线检查，判断标准与人类AS患者判断标准相同：0 级：影像学检查未见病变，骨质结构完全正常；Ⅰ级：骨关节疑似存在硬化、侵蚀现象；Ⅱ级：可见明显硬化及侵蚀现象，并表现出轻度异常情况，但关节间隙不十分明显改变；Ⅲ级：出现明显骨质硬化及侵袭现象，可见骨质重度异常，关节腔隙可见明显改变，见部分强直变化；Ⅳ级：大部分脊柱出现强直变化或完全强直，表现出严重骨关节结构异常[7]。再配合细胞因子检查：C-反应蛋白(C-reactionprotein，CRP)、含有瓜氨酸抗体的抗环肽(抗CCP抗体)、抗链球菌溶血素O(anti-Streptolysin，ASO)、降钙素原(procalcitonin，PCT)和类风湿因子(IgG-RF& IgM-RF)。并排除其他疾病，如(1)自身免疫性疾病(类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等)；(2)合并感染性疾病或贫血；(3)患有血液学疾病；(4)肝、肾功能损害；(5)患有心脑血管疾病；(6)患有恶性肿瘤。

1.3.2 样本采集

(1)血常规样本采集

动物禁食过夜后，非麻醉状态下使用 2 mL 含乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)真空采血管对实验动物采用前肢头静脉采血 2 mL，保存样本并于1.5 h内送检。

(2)血生化样本采集

1976年，美国学者Cremin在《公共教育》一书中正式提出了教育生态学的概念，正式把焦点集中在教育与周围环境因素的相互作用关系，为教育学的发展思路提供了新的视角。1987年，美国学者Goodlad提出了“文化生态系统(cultural ecosystems)”的概念，指出学校应从管理入手统筹各种生态因子提高办学效果。

动物禁食过夜后，非麻醉状态下使用 3 mL 促凝真空管对实验动物采用前肢静脉采血3 mL，样本于1.5 h 内送检。血液样本室温下静置3 h后，3000 r/min，离心10 min，取血清。

1.3.3 指标测定

(1)血常规指标测定

使用 Sysmex XN-1000 V 全自动血液分析仪对动物抗凝血进行以下指标测定:白细胞计数(WBC)、血小板计数(PLT)、平均血小板体积(MPV)、中性粒细胞(NEUT)、淋巴细胞(LYMPH)、单核细胞(MONO)、嗜酸性粒细胞(EO)、嗜碱性粒细胞(BASO)。计算中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)、单核细胞与淋巴细胞比值(MLR)、嗜酸性粒细胞与淋巴细胞比值(ELR)、嗜碱性粒细胞与淋巴细胞比值(BLR)。

(2)血生化指标测定

使用全自动生化分析仪检测本实验相关的生化指标，包括：碱性磷酸酶(ALP)、甘油三酯(TG)、白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)、球蛋白(GLOB)、总胆固醇(CHO)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、白蛋白与球蛋白比值(A/G)。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 AS组食蟹猴与对照组食蟹猴的检测指标的比较

与对照组相比，AS组WBC、NEUT、MONO、EO、BOSO、MPV、NLR、MLR、ELR和BLR均显著升高，LYMPH显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；PLT无显著性差异(P>0.05)。见表1。

表1 AS组与对照组的血常规指标的对比Table 1 Comparison of complete blood count indexes between AS group and control group

2.1.2 血生化指标的比较

与对照组相比，AS组TP、GLOB、ALP、CHO显著升高；ALB、A/G、HDL-C、LDL-C显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；TG无显著性差异(P>0.05)。见表2。

2.2 ROC曲线评价研究指标对AS食蟹猴的诊断价值

2.2.1 血常规指标对AS食蟹猴的诊断价值

使用ROC来评价MPV、WBC、BASO、EO、MONO、LYMPH、NEUT、NLR、MLR、ELR和BLR对AS食蟹猴的诊断价值，结果显示它们的AUC值分别是：0.736(0.626～0.846)、0.788(0.688～0.889)、0.683(0.566～0.801)、0.815(0.716～0.914)、0.681(0.564～0.797)、0.215(0.118～0.313)、0.85(0.768～0.933)、0.894(0.826～0.961)、0.896(0.828～0.963)、0.87(0.789～0.951)、0.897(0.832～0.963)。其中各白细胞比值(NLR、MLR、BLR、ELR)的AUC值均高于其他指标，BLR的AUC值最高，灵敏度和特异度分别为0.75和0.92。(图1、表3)

表2 AS组与对照组的血生化指标的对比Table 2 Comparison of blood biochemical indexes between AS group and control group

2.2.2 血生化指标对AS食蟹猴的诊断价值

使用ROC来评价TP、ALB、GLOB、A/G、CHO、HDL-C、LDL-C和ALP对AS食蟹猴的诊断价值，结果显示它们的AUC值分别是：0.678(0.562～0.795)、0.048(0.007～0.09)、0.942(0.889～0.995)、0.047(0.002～0.091)、0.719(0.606～0.831)、0.295(0.182～0.408)、0.333(0.211～0.455)、0.934(0.880～0.987)。其中GLOB和ALP的AUC值均高于其他指标，GLOB的AUC值最高，灵敏度和特异度分别为0.878和0.975。(表4、图2)

图1 ROC曲线评价研究血常规指标对AS 食蟹猴的诊断价值Figure 1 The ROC curve was used to evaluate the diagnostic value of the complete blood count index for AS cynomolgus monkeys

表3 ROC曲线评价血常规指标对AS食蟹猴的诊断价值Table 3 The ROC curve was used to evaluate the diagnostic value of the complete blood count index for AS cynomolgus monkeys

表4 ROC曲线评价血生化指标对AS食蟹猴的诊断价值Table 4 The ROC curve was used to evaluate the diagnostic value of the complete blood count index for AS cynomolgus monkeys

图2 ROC曲线评价研究血生化指标对AS 食蟹猴的诊断价值Figure 2 The ROC curve was used to evaluate the diagnostic value of the blood biochemical index for AS cynomolgus monkeys

3 讨论

强直性脊柱炎是以中轴和骶髂附着点炎症为主要症状的全身免疫性疾病，发病早、致残率高、病程长，目前尚无良好的治疗手段[10]。目前，AS的病情评估和诊断主要依靠临床表现、影像学及ESR、CRP等指标检查，但是影像学检查价格昂贵且不便，不适合AS食蟹猴较多数量的初筛。本研究通过对血常规、白细胞比值(NLR、MLR、ELR、BLR)和血生化部分指标的分析来探究各指标对AS食蟹猴的诊断价值。

NLR和MLR作为炎症标志物在很多疾病中被关注，NLR和MLR异常增加与一些疾病炎症活动或预后有关，如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、骨关节炎等[11-12]。本研究结果显示与正常对照组的食蟹猴相比，AS食蟹猴的NLR和MLR均显著升高。也有文献结果显示在AS中NLR与ESR和CRP呈正相关[13]，MLR与CRP呈正相关[14-15]。嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞都是一种免疫效应细胞，通常占血液白细胞的5%和1%以下。本研究结果表明在AS食蟹猴中EO和BASO均显著增高，这可能与AS是一种慢性炎症为主的自身免疫性疾病有关。周振兴等[16]研究表明由于大量炎症介质和细胞因子的异常分泌导致患者嗜酸性粒细胞显著增高；嗜碱性粒细胞除了在过敏反应和寄生虫感染中的活性外，Chirumbolo等[17]研究证明在固有免疫和免疫调节中具有重要作用发生炎症时血液中的血细胞比例发生变化。目前关于ELR和BLR的研究较少，但是在本研究结果中AS食蟹猴的ELR和BLR升高，并有统计学意义，这与Yang等[13]的研究中关于AS病人的结果基本一致。MPV是血小板活化的标志物，Kisacik等[18]研究发现MPV可能是诊断AS灵敏度更高的指标，并且发现MPV在AS的活动期呈较低水平，在非活动期MPV水平较高。在我们的研究结果中AS组的食蟹猴较正常对照组的食蟹猴的MPV显著升高，而PLT无显著性差异，与Kisacik等[18]的研究结果中的AS病人非活动期指标变化相符。本研究探讨血常规和血生化指标的检测对自发性AS食蟹猴的诊断价值。ROC曲线结果显示，在血常规指标中，白细胞比值的各指标(NLR、MLR、ELR、BLR)的灵敏性和特异性都均高于各类白细胞指标，与文献报道一致[14]。

ALP 主要由肝和成骨细胞合成，是反映成骨活动的重要标志物，本研究结果显示AS食蟹猴ALP显著升高，这可能是随着疾病进程会出现脊柱及关节骨化导致。GLOB 是一个计算值,是血清中的“非白蛋白”蛋白的总量,免疫反应增强是AS重要的临床表现,GLOB的升高可能是由于AS的炎症特征导致机体免疫蛋白升高。张晓刚等[19]的研究结果表现为人类AS患者的TG和CHO显著升高，LDL-C和HDL-C 下降，与本研究结果中AS食蟹猴的指标大致相同。ALB是主要用于反映机体营养状态和慢性消耗性疾病的指标之一[20-21]，AS食蟹猴由于疼痛和全身炎症会导致机体营养吸收和物质代谢能力降低，从而表现出ALB和A/G低于正常食蟹猴。在血生化指标中，GLOB和ALP的AUC值均大于0.9，证明它们对于AS食蟹猴的诊断灵敏度和特异度较好。

综合上述讨论，本研究发现血常规、血生化检查可作为一种快速、简便、可靠的手段，对自发AS食蟹猴模型进行筛查、诊断和相关药物的评价提供辅助诊断的手段。综合ROC曲线结果，指标NLR、MLR、ELR、BLR、ALP和GLOB是本研究指标中灵敏度和特异度最佳的六个指标，并且它们的变化可能与AS疾病活动度有关，对AS有重要的临床应用价值。但是，本研究样本量相对较小，还需后续进行纵向研究，包括较大量的数据分析来进一步探究这些指标与疾病活动度的相关情况。