七氟醚预处理对老年大鼠认知功能障碍的影响及海马区自噬在其中的作用研究

谢 翼，王 凯，牛 敏

(1.山东省淄博市中心医院，山东 淄博 255034； 2.山东省日照市人民医院， 山东 日照 276800)

术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction, POCD)是老年病人手术后出现中枢神经系统并发症，表现为精神错乱、焦虑、人格的改变以及记忆受损。目前POCD机制尚未明了，研究方向主要集中在中枢胆碱能系统功能障碍、炎症反应、神经细胞凋亡等领域[1-2]。

自噬(autophagy)是细胞内容物分解代谢的过程，作为一种高度调节的细胞机制，与多种疾病的生理病理情况有关[3]。近年来研究表明[4-5]，上调自噬水平可能保护神经退行性变，调节自噬可能成为治疗阿尔茨海默病、亨廷顿病和帕金森病等神经退行性疾病的新策略。还有研究表明，麻醉诱导应激可能导致海马水平的改变和认知障碍[6]。本实验将老年大鼠暴露于七氟醚后，采用Morris水迷宫，Western blot检测自噬及凋亡相关蛋白表达等方法，证实了海马区自噬在七氟醚麻醉诱导的神经退行性变中起作用，为POCD的治疗提供了一个新的潜在靶点及理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

72只SPF级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，20月龄，体重550～750 g，购自济南朋悦实验动物繁殖有限公司[SCXK(鲁)2019-0011]。实验前适应性饲养在淄博市中心医院[SYXK(鲁)2017-0023)]一周，室温(22±2)℃，所有大鼠均自由摄食、饮用蒸馏水，维持12 h光照和12 h黑暗交替循环的环境。本研究获得本院动物伦理委员会批准(20190623)，依据3R原则进行实验。

1.2 主要试剂与仪器

七氟醚(山东，鲁南贝特制药有限公司)；雷帕霉素、氯喹(美国，Sigma公司)；p-mTOR、mTOR、Bcl-2、Cl-Caspase3、p-S6K1、S6K1抗体(美国，Novus Biologicals公司)；Bax、p62抗体(美国，Abcam公司)；TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(南京，凯基生物工程公司)； Maxima SYBR Green及cDNA 合成试剂盒(美国，Thermo 公司)；透射电子显微镜(日本，HT7800)；电泳仪(北京六一，DYCZ-24DN)；血气分析仪(丹麦，ABL80)；大鼠Morris水迷宫(上海欣软，water Maze)。

1.3 实验方法

1.3.1 分组及模型建立

大鼠随机分为6组(每组12只)：对照组(CON)、雷帕霉素组(RAP)、氯喹组(CQ)、七氟醚组(SEV)、七氟醚+雷帕霉素组(SEV+RAP)、七氟醚+氯喹组(SEV+CQ)。雷帕霉素和氯喹分别用二甲基亚砜溶解并稀释制成25 mg/mL的溶液，再用5%的聚乙二醇400和5%吐温80溶液进一步稀释成10 mg/mL的溶液。RAP与SEV+RAP组于麻醉前静脉注射20 mg/(kg·d)的雷帕霉素，CQ和SEV+CQ组于麻醉前静脉注射20 mg/(kg·d)氯喹，均连续7 d。CON和SEV组静脉注射等体积的空白溶剂。大鼠放入麻醉箱后，SEV、SEV+RAP与SEV+CQ组开启2%七氟醚和30% O2混合气，连续麻醉5 h；CON、RAP与CQ组大鼠开启30% O2连续5 h。

1.3.2 生理指标分析

实验结束后，每组随机选3只大鼠抽取1 mL动脉血，使用血气分析仪观察pH值、PaCO2、PaO2、SaO2及血糖指标变化。

1.3.3 行为学测试

七氟醚暴露24 h后，采用Morris水迷宫测试大鼠的空间记忆能力，平台(直径10 cm)固定在游泳池的四个象限之一。连续训练5 d，每天4次。将平台被淹没在水下1 cm处，每一次实验时，观察大鼠在水中找到平台并爬上平台的时间，记为逃避潜伏期；如果在120 s内不能找到平台，则人为将其引导到平台，并停留10 s，将逃避潜伏期记为120 s；当老鼠到达平台时，他们被允许在上面休息30 s；记录找到隐藏平台所需的时间(逃避潜伏期)。四次的平均时间为大鼠当日的结果。每次实验后，老鼠被擦干，然后放回笼子。第5天，在去除平台后进行空间探索实验，记录120 s内老鼠穿过原平台位置的次数和在目标象限的停留时间。

1.3.4 取材

Morris水迷宫测试结束后，将所有大鼠麻醉处死，每组将3只大鼠取出全脑，切除脑海马组织，左侧用于TEM观察，右侧用于TUNEL分析。其它9只大鼠快速剥离海马，切除双侧海马组织，迅速置于液氮冷冻，用于Western blot和RT-qPCR分析。

1.3.5 TEM观察海马神经元自噬

取左侧海马组织，置于2.5%戊二醛中，4℃固定过夜，磷酸缓冲盐冲洗三次，1%锇酸固定2 h，水冲洗，常规脱水，包埋，切片，经4%乙酸铀染色20 min、0.5%柠檬酸铅染色5 min，镜下观察海马神经元自噬体。

1.3.6 TUNEL法检测海马细胞凋亡

按TUNEL试剂盒使用说明书进行操作，于显微镜下观察，计数海马CA1区的凋亡细胞(凋亡细胞细胞核呈棕色)及细胞总数，其比值即为相对细胞凋亡率[7]。

1.3.7 RT-qPCR检测海马组织中LC3 mRNA表达

取海马组织[8]，加入TRIzol试剂提取待测组织总RNA，以提取的总RNA为模板按逆转录试剂盒说明合成cDNA，取 2 μL cDNA用于 RT-qPCR 反应。β-actin上游引物：5’-AGCACAGAGCCTCGC CTTT-3’；下游引物：5’-AGGGTGAGGATGCCTCTC TT-3’；LC3上游引物5’-AGCAGCATCCAACCA AAATC-3’； 下游引物：5’-CTGTGTCCGTTC ACCAACAG-3’)，以β-actin作为内参，根据公式mRNA=2-△△Ct计算分析海马组织中基因的相对表达水平。

1.3.8 Western blot法检测海马组织中p-S6K1、Cl-Caspase3、p62、p-mTOR、Bax、Bcl-2蛋白表达水平

取50 mg海马组织加入适量的RIPA裂解液，匀浆后，离心10 min，收集上清液，BCA试剂盒检测总蛋白浓度。然后上样、电泳、转膜，含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭2 h，加一抗4℃孵育过夜，加二抗37℃孵育2 h，TBST漂洗，ECL显色。采用Image图像软件对蛋白质条带进行分析，目的蛋白与β-actin密度的比值作为目的蛋白的相对含量。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 各组生理指标分析结果

在七氟醚麻醉或假暴露结束时，对每组3只大鼠的动脉血样进行血气及血糖分析。与对照组比较，其余实验组血样中pH、PaCO2、PaO2、葡萄糖、SaO2值无显著性差异(P>0.05)，见表1。

2.2 Morris水迷宫测试各组大鼠行为学结果

与CON组比较，SEV组大鼠逃避潜伏期延长(P<0.01)，目标象限时间百分比下降(P<0.05)，穿越平台次数减少(P<0.01)；与SEV组比较，SEV+RAP组逃避潜伏期缩短，目标象限时间百分比增加、穿越平台次数增加(P<0.05)；而SEV+CQ组逃避潜伏期延长，目标象限时间百分比下降、穿越平台次数减少减少(P<0.05)；CON和RAP组、CON和CQ组大鼠逃避潜伏期、目标象限时间百分比、穿越平台次数无显著性差异(P>0.05)，见图1A、1B、1C。

表1 各组老年大鼠动脉血气比较Table 1 Comparison of arterial blood gas of aged rats in each group

2.3 TEM观察大鼠海马神经元自噬变化

与CON组比较，RAP、CQ及SEV组的海马神经元自噬泡数量增加(P<0.05)；与SEV组比较，SEV+RAP和SEV+CQ组自噬泡数量也增加(P<0.05)，CQ和SEV+CQ两组间自噬泡数量无显著性差异(P>0.05)，见图2。

2.4 TUNEL法染色观察神经元凋亡情况

与CON比较，SEV组细胞凋亡率增加(P<0.01)，RAP、CQ组无显著差异(P>0.05)；与SEV比较，SEV+CQ组的细胞凋亡率增加，SEV+RAP组降低(P< 0.05)，见图3。

2.5 RT-qPCR检测大鼠LC3 mRNA的表达

与CON组比较，RAP组 LC3 mRNA表达水平升高(P< 0.01)；与SEV组比较，SEV+RAP组 LC3 mRNA表达水平升高(P< 0.01)，见图4。

2.6 Westernblot检测海马p62、Bcl-2、Cl-caspase-3、Bax、p-mTOR、p-S6K1蛋白表达

与CON组比较，SEV组的p62、Cl-caspase-3和Bax表达升高(P<0.05)，Bcl-2表达降低(P<0.01)。与SEV组比较，SEV+RAP组p62、Cl-caspase-3和Bax表达降低(P<0.05)，Bcl-2表达升高(P<0.01)，p-mTOR、p-S6K1表达下降(P<0.01)，而SEV+CQ组p62、Cl-caspase-3和Bax 表达升高(P<0.05)，Bcl-2表达降低(P>0.05)，见图5。

注：与七氟醚组比较，**P<0.01，*P<0.05；与对照组比较，#P>0.05。下同。图1 各组大鼠行为学结果Note. Compared with SEV group, **P<0.01,*P<0.05. Compared with CON group,#P>0.05. The same as below.Figure 1 Behavioral results of rats in each group

图2 各组大鼠海马神经元自噬泡数量比较Figure 2 Comparison of autophagy of hippocampal neurons in each group

图3 各组大鼠海马细胞凋亡率Figure 3 Apoptosis ratio of cells in the hippocampus of rats in each group

图4 七氟醚麻醉后大鼠海马LC3 mRNA表达 情况Figure 4 Effect of sevoflurane anesthesia on LC3 mRNA expression in rats

图5 七氟醚麻醉后对大鼠海马区相关因子表达的 影响Figure 5 Effects of sevoflurane anesthesia on the expression of related factors in hippocampus of rats

3 讨论

POCD是术后出现的一种中枢神经系统并发症，尽管人们已经普遍认识到POCD的危害性，但其具体的发病机制、病理生理还未被阐明。七氟醚是临床常用的吸入性麻醉药，对术后认知功能有影响，但发生机制尚不明确。研究表明，七氟醚吸入麻醉引起老年患者POCD发生率高于静脉注射异丙酚的老年患者[8]。本实验对大鼠生理指标检测发现，与对照组相比，各实验组生理指标值均无显著性差异(P>0.05)，这说明七氟醚预处理对大鼠生理改变无明显影响。

由于雄性大鼠比较强壮，雌性体质相对比较弱，容易有别的因素(吃的食物，生活环境等)干扰实验效果，因此选择雄性大鼠进行实验。海马组织主要负责存储信息，是人学习和记忆的关键功能区认知区域之一。病理研究表明，当发生轻度认知功能障碍时，海马具有神经可塑性[9]。Morris水迷宫是研究海马空间学习记忆的重要评估工具[10]。本实验水迷宫结果显示，七氟醚麻醉后老年大鼠出现了认知障碍，而RAP、CQ组大鼠空间学习记忆能力无明显差别，提示RAP、CQ分别单独给药对老年大鼠认知功能无影响。与SEV组比较，SEV+RAP组大鼠认知障碍明显改善，说明雷帕霉素治疗可以改善七氟醚引起的认知障碍。而SEV+CQ组则进一步加剧了七氟醚诱导引起的认知功能障碍，提示七氟醚麻醉导致大鼠空间记忆的损害可能与海马自噬有关。

自噬是细胞在应激状态下再利用的重要分解代谢过程，在维持细胞稳态和应激状态下保留细胞生存能力方面发挥重要作用[11]。微管相关蛋白轻链3(LC3)是存在于哺乳动物体内的自噬基因，其表达水平在某种程度上反映了细胞的自噬活性[12]；p62包含多种蛋白作用域，可结合聚泛素化蛋白并将其进一步降解，通常细胞内 P62 蛋白的水平与自噬活性的强弱呈负相关性[13-14]。Western blot结果显示，与CON组相比，SEV组p62蛋白表达上升(P<0.05)，而SEV+RAP组p62表达低于SEV组(P<0.05)，这说明七氟醚能抑制老年大鼠自噬通道。同时TEM观察显示，SEV+CQ、SEV+RAP组的自噬泡数量高于SEV组，而CQ和SEV+CQ组的自噬泡数量则无显著性差异，这些证据进一步表明七氟醚诱导老年大鼠海马自噬受损。RT-qPCR结果显示，CQ组及SEV+CQ组对LC3 mRNA影响不大，但雷帕霉素(RAP)提高了LC3 mRNA水平，且TUNEL法观察发现SEV+RAP组海马神经元凋亡率较SEV组下降(P<0.05)，这说明雷帕霉素上调LC3 mRNA表达从而增加自噬活性，维持细胞内稳态，阻止细胞凋亡。mTOR是一个重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在进化上非常保守，它对细胞自噬起着负调控作用，而S6K1是mTOR下游效应分子之一。Westernblot结果显示，与CON组相比，RAP显著抑制p-mTOR及其下游p-S6K1表达(P<0.01)，而SEV+RAP组p-mTOR和p-S6K1表达较SEV组表达下调，我们推测雷帕霉素可能通过抑制mTOR途径减少p-S6K1的积累，增强了自噬，而SEV可能通过激活mTOR通路，起到抑制自噬的作用。

研究指出，七氟醚麻醉可以引起老年大鼠内质网应激反应，内质网中未折叠蛋白的过度积累会引起内质网应激，损伤细胞器，诱导细胞进入凋亡程序[15]。Bcl 2蛋白家族和胱天蛋白酶(Caspase)家族在细胞凋亡过程中起着关键性作用，其中Bcl 2抑制细胞凋亡，而Bax为促凋亡因子，Caspase-3是凋亡级联反应中处于核心地位的蛋白，通过三者表达的变化可判断细胞凋亡[16]。Western blot结果显示，七氟醚麻醉后大鼠Bcl-2水平显著降低，Caspase-3和Bax水平显著升高，TUNEL法染色观察到七氟醚麻醉后海马相对细胞凋亡率明显增加，验证了七氟醚麻醉能诱导细胞凋亡；而雷帕霉素预给药后，与SEV组大鼠比较，Bcl-2水平显著升高，Caspase-3、Bax水平及细胞凋亡率均明显降低，提示自噬可能通过阻断凋亡，从而促进细胞存活。

综上所述，七氟醚麻醉后可显著损害老年大鼠记忆能力，诱导海马神经元凋亡，而联合雷帕霉素治疗则可以改善七氟醚诱导的自噬通道受损。这些发现表明，七氟醚麻醉导致老年大鼠认知功能障碍与海马神经元的自噬受损有关。