泰山黄精多糖提取工艺改进及抑菌作用*

于伟凯 孔维楷 郝斯璐 刘晓阳 刘 冰 李宇飞 孟 超

山东第一医科大学(山东省医学科学院)生命科学学院，山东 泰安 271016

黄精是百合科黄精属的草本植物，常见种黄精、云南黄精或多花黄精[1]。广泛分布于我国长江以南大部分地区[2]，多见于树下和灌木丛中。属于传统的中药材，是药食同源[3]，出现在《名医别录》中。

由于黄精有较好的实用性药用功能，并且其主要有效成分包括多糖类，有抗肿瘤、免疫调节、延缓衰老以及抗菌抗病毒等作用[4]。近几年开展了许多研究多花黄精多糖的实验[5-6]，少有研究泰山黄精的实验。微波辅助法具有耗能低、提取率高、效率高等特点[7]，优于较常采用的水提醇沉法。

本实验以微波辅助法提取分离泰山黄精中的多糖成分，以此进一步探究在不同的实验条件下其提取的最佳条件及多糖的抑菌效果，更好的研发泰山黄精的药用价值。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1植物材料和菌种 种植的泰山黄精植株。大肠杆菌和金黄色葡糖球菌菌种(山东第一医科大学(山东省医学科学院)生命科学学院)。

1.1.2实验试剂 500 mL 氯仿、500 mL 95%乙醇、500 mL石油醚、500 mL无水乙醇、500 mL浓硫酸,以上皆为分析纯，标准葡萄糖品。

1.1.3实验仪器 SPX-250B5H-Ⅱ型生化培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)；G70F23CN2P-BM1(S0)微波炉(格兰仕微波炉电器有限公司)；烘干箱；京制00000249号电子分析天平(丹佛仪器有限公司)；RE-52A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；真空抽滤机；SW-CJ-2FD型V-5100可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)；3-30K型低温高速离心机(Sigma公司)；HVE-50型高温灭菌锅(上海精宏实验设备有限公司)；超净工作台、温度计、索氏提取器、量筒、烧杯、锥形瓶等常规实验仪器。

1.2 方法

1.2.1泰山黄精多糖的提取 提前将泰山黄精根茎切块和干燥，取出进行研磨粉碎处理。将粉碎好的泰山黄精粉末包好，先后用石油醚和95%乙醇，于90 ℃的条件下各回流提取2次，完成后取出，烘干。准确称量泰山黄精粉末1.5 g，放入到锥形瓶中，分别加入不同体积的蒸馏水，搅拌。将泰山黄精粉末放入微波炉中，调节微波加热的功率、时间。加热完后，在4 000 r/min的条件下离心15 min，弃沉淀，留上清。后在65 ℃条件下旋蒸到原体积的1/4，量出剩余溶液的体积。配成氯仿︰正丁醇体积比为4∶1的溶液，取成品溶液加入到分馏漏斗中，再加入配制好的溶液，上下剧烈摇动数次，待静置分层后，将上层溶液倒入锥形瓶中保存。将3倍体积的无水乙醇倒入处理液中，轻轻摇动，在冰箱中放置过夜，在4 000 r/min的转速下离心0.25 min，沉淀出多糖的粗品。这些样品用无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤，低温干燥，沉淀后进行后续实验。

1.2.2单一提取条件试验 (1)选择料液比试验：保持加热时间2 min、加热功率350 W不变，分析1∶20、1∶25、1∶30、1∶35的条件下泰山黄精多糖提取率。(2)微波加热功率选择试验：当微波加热时间为2 min，料液比为最佳提取率时,分析微波加热功率210、280、350、420 W时泰山黄精多糖提取率。(3)微波加热时间选择试验：当微波加热功率为最优功率，料液比为最优提取率时，分析微波加热1.0、1.5、2.0、2.5 min时的泰山黄精多糖提取率。

1.2.3正交试验设计 设计正交试验确定最佳提取多糖条件组合。如表1。

表1 L9(33)正交试验因素水平表

1.2.4泰山黄精多糖的测定 配置标准葡萄糖溶液和6%的苯酚溶液，0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL的标准葡萄糖溶液，分别加入9只试管中。加入蒸馏水，定容至2 mL，再加入5 mL浓硫酸和1 mL 6%苯酚，静置20 min，测定紫外吸光度，做出其标准曲线图，如图1，于波长490 nm下知标准曲线的回归方程是：y=7.3315x+0.0195，相关系数R2=0.996。

图1 苯酚-硫酸标准曲线

1.3 抑菌作用的研究

抑菌实验利用大肠杆菌和金黄色葡糖球菌进行滤纸片法操作。将提取的多糖分别配置制成浓度为2.0%、3.0%、4.0%等不同浓度的抑菌液，然后配置低浓度的氨苄青霉素钠溶液(阳性对照)，已备好的6个平板中倒入已灭菌的培养基，使其分布均匀，待凝固向每个平板中均打入20 μL菌液，用涂布棒涂匀。分别向不同的滤纸片依次浸润蒸馏水、氨苄青霉素钠溶液和不同浓度的多糖溶液，等待微干后，用镊子向6个平板中加入被蒸馏水浸湿的滤纸片及氨苄青霉素钠溶液的滤纸片,分别作为阴性和阳性对照，再依次按照从低到高的浓度梯度加入多糖溶液的滤纸片。37 ℃恒温箱倒置培养24 h后，根据抑菌圈大小比较抑菌效果。

1.4 统计学分析

2 结果与分析

2.1 泰山黄精多糖的单因素试验分析

2.1.1料液比对提取率的影响 依据1.2.2中(1)的方法，产生影响如表2。

表2 料液比对提取率的影响

经过计算可以得出，加热时间2 min，加热功率350 W，料液比1∶30时多糖提取率4.46 %最大。

2.1.2加热功率对提取率的影响 依据1.2.2中(2)的方法，产生影响如表3。

表3 加热功率对提取率的影响

分析可得，料液比1∶30、加热时间2 min、加热功率350 W时泰山黄精多糖的提取率4.06 %最大。

2.1.3加热时间对提取率的影响 依据1.2.2中(3)的方法，产生影响如表4。

表4 加热时间对提取率的影响

通过表4可以得出，当料液比1∶30、加热功率350 W、加热时间2 min时泰山黄精多糖的提取率4.38 %最大。

2.2 正交试验分析

L9(33)泰山黄精多糖提取率的不同受正交试验的影响见表5。

表5 多糖提取率受L9(33)正交试验的影响

经过SPSS 20.0分析验证，进行了方差分析，PA=0.018，PB=0.021，PC=0.03，均小于0.05,说明料液比、微波加热功率和加热时间均可影响多糖的提取且加热时间的影响程度最大，料液比次之，最佳条件组合下，提取率高达4.83 %。

2.3 抑菌结果分析

2.3.1泰山黄精多糖对大肠杆菌的抑制作用 抑菌方法：滤纸片法，以氨苄青霉素钠作为阳性对照，无菌蒸馏水为阴性对照，结束培养箱培养24 h后，观察抑菌效果。比较不同浓度的多糖抑菌圈直径的大小，见表6。

表6 泰山黄精多糖对大肠杆菌的抑制作用

经过SPSS 20.0方差分析验证，P<0.001，具有统计学意义，即泰山黄精多糖可以很好的抑制大肠杆菌，最低浓度为2%。

2.3.2泰山黄精多糖对金黄色葡萄球菌的抑制作用 抑菌方法：滤纸片法，平板于培养箱24 h后，根据抑菌圈直径比较抑菌效果。阳性对照为氨苄青霉素钠，阴性对照是无菌蒸馏水，通过观察证明泰山黄精多糖可抑制金黄色葡萄球菌，见表7。

表7 泰山黄精多糖对金黄色葡萄球菌的抑制作用

经过SPSS 20.0方差分析验证，P<0.001，具有统计学意义，证明泰山黄精多糖对金黄色葡萄球菌的抑制效果很好，且浓度越高抑菌圈越大，最低抑菌浓度均为2%。

3 讨 论

多糖作为泰山黄精的主要成分，具有良好的发展前景。近年对于泰山黄精多糖的抑菌性研究较少，故本实验主要研究泰山黄精多糖的提取最佳条件及抑菌活性。

因微波加热特殊性，微波助提多糖较水提取法所需时间大大缩短[8]，故相较于梁引库[9]关于黄精多糖提取工艺的研究，本研究黄精多糖提取率更高，时间更短；据试验结果分析，黄精多糖最佳提取工艺为：料液比1∶30，微波加热时间2 min，微波加热功率280 W。按最佳条件组合，检验试验得黄精多糖提取率是4.96%，高于正交试验的最高值4.83%，表明试验优化具有意义。但考察因素目前较为单一，后续实验仍可进一步考察提取温度、次数等。多花黄精多糖对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等实验菌都有较好的抑菌效果[10]，由实验所得抑菌圈直径证实，泰山黄精多糖的抑菌效果对大肠杆菌更强,且最低抑菌浓度2.0%，此可作为其开发成天然抑菌剂的理论依据。

本实验采用浓硫酸-苯酚法测量多糖含量，虽准确可靠[11]，但不能分析多糖结构,可以改进测定方法。泰山黄精内还可提取出除多糖外具有抑菌作用的物质[12]，且黄精多糖无明显的毒副作用，因此对于泰山黄精的研究有很大的意义[13]。