ALP、AST、CK活性随血痕经过时间演变的实验性研究

赵媛中 李宝华 张 倩 殷 霞 张 苗 孙文平

山东第一医科大学(山东省医学科学院)1.基础医学院，2.公共卫生学院，山东 泰安 271016

血痕是涉及人体伤害案件现场常见的生物物证，其形成时间与犯罪发生时间密切相关，推断血痕的经过时间对判断案发时间具有重要意义。由于血痕样本的复杂性以及检测分析手段的缺乏，使血痕分析成为生物化学表征的一个具有挑战性的目标。揭示和评价血液成分的老化过程是法医学研究中一个尚未解决的问题，有助于阐明犯罪细节。

血液成分复杂，含有遗传物质以及多种可作为生物标记的蛋白质和低分子量化合物。过去人们通过端粒缩短或线粒体DNA缺失的积累程度，用遗传方法来确定个体年龄和血痕遗留时间，但这些方法显示出较低的准确性，限制了其在法医学上的应用。有学者通过采用生物级联催化方法对48 h内血痕中ALT活性进行检测分析，结果发现通过建立回归分析定量模型，能较准确地预测干燥血痕的经过时间，因此，检测血痕中酶活性的改变在预测血痕遗留时间推断上可能具有较高的应用价值[1]。本研究旨在探讨实验室条件下血痕中碱性磷酸酶(ALP)、谷草转氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)活性随时间的演变规律，以期为推断案发时间提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 血液采集与样本制备

随机选择40名健康志愿者(20～21岁，男女各半)，利用一次性采血针分别对其进行肘静脉取血，每人采血5 mL备用。从每个样本取血0.3 mL分别滴加到12个载玻片上，标记英文字母以对应12个检测时间点。控制实验室环境温度25 ℃，湿度60%，自然光照、干燥。

1.2 仪器与试剂

瑞士罗氏c311全自动血生化仪，南京建成ALP、AST、CK酶活性检测试剂盒。

1.3 实验分组与样本检测方法

本实验设定1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42 d共12个检测时间点。检测前，将对应时间点的载玻片血痕用0.3 mL蒸馏水重新溶解，移液器吸取加入到EP管内，3 000 r/min离心5 min，取上清用于检测。ALP、AST、CK活性检测分别按照所对应试剂盒说明书进行操作。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 不同经过时间的干燥血痕中ALP的活性变化

在实验设定条件下对每个样本12个时间点血痕中ALP的活性进行检测，可统计出ALP活性改变的趋势。5 d内血痕中ALP活性比较稳定，随后呈平缓下降趋势，结果如图1、表1所示。

图1 不同经过时间血痕中的ALP活性随时间的变化趋势

2.2 不同经过时间的干燥血痕中AST的活性变化

在实验设定的12个时间点对样本血痕中AST的活性进行检测，可统计出AST活性变化的趋势。血痕形成4 d内，AST活性保持稳定，5 d后呈明显上升趋势，4 w后变化趋于稳定，结果如图2、表1所示。

图2 不同经过时间血痕中的AST活性随时间的变化趋势

2.3 不同经过时间的干燥血痕中CK的活性变化

在实验设定的12个时间点对血痕中CK的活性进行检测，可统计出CK活性改变的趋势。在血痕形成6 d内，CK活性急剧降低，随后下降趋势减慢，14 d之后变化趋于平缓，结果如图3、表1所示。

图3 不同经过时间的干燥血痕中CK的活性变化

表1 血痕CK、AST、ALP活性随时间变化趋势

3 讨 论

作为法医血清学的一个分支，血液、唾液、汗液等生物样品的分析在提供有关犯罪的客观事实方面为刑事诉讼作出了巨大贡献。在涉及刑事犯罪的法医学实践中，命案现场往往会遗留大量血痕，判断血痕的形成时间可为案件的侦破提供有价值的重要信息。血痕经过时间的研究国内外已有报道，主要包括利用光谱技术(如拉曼光谱、红外光谱等)进行血痕来源种属鉴定及分析全血中血红蛋白及其他成分的降解规律[2-3]、利用智能手机分析血痕演化的形态特征[4]、PCR技术检测分析血痕中RNA的降解[5]等方面。

本研究测定了在6周内12个时间点血痕中ALP、AST、CK的活性改变，从以上结果可以看出，ALP活性在各个检测时间点的变化较为平缓，总体呈缓慢下降趋势；AST活性在前4 d变化不明显，从5 d起明显升高一直持续到35 d，维持在高活性状态，随后开始缓慢下降；CK活性在1周内迅速下降，而2周后变化则趋于平缓。因此我们认为，检测AST和CK的活性改变能较好地反应短期内(1周)血痕经过时间，而ALP活性变化比较适合血痕形成较久的时间推断。本次研究表明，血痕中ALP、AST、CK等酶活性的改变可以作为确定犯罪现场血痕遗留时间的推断工具。在真实的犯罪现场中，温度、湿度、光照以及生物破坏等多种环境条件会不同程度地影响酶活性。在今后的研究中，可以设定多个变量因素条件下检测不同酶活性的变化规律，期待建立相应的回归方程，为血痕经过时间的法医学推断提供有实用价值的参考指标。