迷迭香醇提物对臭氧模型小鼠抗氧化能力的影响*

颜少帅 张小可 杨现霞 王 虹

1.山东第一医科大学(山东省医学科学院)化学与制药工程学院，山东 泰安 271016；2.大连交通大学材料科学与工程学院，辽宁 大连 116028

迷迭香为唇形科草本植物。迷迭香中含有多种具有生理活性的化学成分，如：萜类、酚酸类、黄酮类等，其中萜类成分的鼠尾草酸、尾草酚、迷迭香酚和迷迭香酸等是其主要的抗氧活性成分[1-3]。近年来，迷迭香因其含有的天然抗氧化活性成分，在医药、化妆品等领域也具有重要研究意义，迷迭香抗氧化剂已成为天然抗氧化剂研究与应用中的热点。臭氧衰老模型是一种急性致衰老模型，在形态、行为及与衰老相关的生化指标的表征中与自然衰老动物模型具有高度相似性,其制备操作简单，效果好，成功率高，是国际上公认的造模方式。本实验建立小鼠臭氧衰老模型模拟阿尔茨海默病时脑内氧化损伤等病变[4]，以吡拉西坦为阳性对照，采用行为学测试及生化指标检测等方法，观察迷迭香提取物对臭氧衰老模型小鼠抗氧化能力的作用并对其可能机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1迷迭香醇提物的制备

通过对水提法和乙醇提取法两种方法分别进行单因素正交实验研究，以迷迭香提取物总黄酮和迷迭香酸的含量为检测标准，确定迷迭香提取物的提取方法为乙醇提取法。提取步骤如下：称取30 g磨碎的迷迭香置于三口烧瓶中，与40%的乙醇溶液按1∶12(m/v)的物料比在70 ℃下反应75 min。静置，减压抽滤，离心，萃取，旋蒸浓缩，将浓缩后的粘稠物放入烘箱，设置烘箱温度为45 ℃，干燥得迷迭香乙醇提取物粉末。经亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定迷迭香提取物中总黄酮的含量为43.58%，经硫酸亚铁比色法测定提取物中迷迭香酸的含量为22.12%，经苯酚-硫酸比色法测定提取物中多糖含量为19.15%。

1.2试剂与仪器

迷迭香酸标准品(纯度≥98%)、芦丁标准品(纯度≥98%)，上海源叶生物科技有限公司；迷迭香，临朐安君中药材种植专业合作社；吡拉西坦片(华润双鹤利民药业济南有限公司)；丙二醛(MDA)检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；WFJ7200型紫外-可见分光光度仪(尤尼柯上海仪器公司)；跳台记录仪(YLS-3T)，北京吉安得科技有限公司；Morris水迷宫(XR-XM101)，上海欣软信息科技有限公司；臭氧发生器(SK-CFG-10)，济南三康环保科技有限公司。

1.3实验动物

昆明种雄性小鼠(泰邦生物科技有限公司)，雌雄各半，体重平均为18～22 g。生产许可证号SCXK(鲁)2003-0011。饲养环境：温度(20～25)℃，湿度 40%～60%，12 h光照交替。

1.4 建模与给药 小鼠适应性喂养1 w后随机分为 4组：分别为空白对照组、臭氧模型组、迷迭香组、吡拉西坦对照组，每组小鼠10只。其中迷迭香组灌胃迷迭香醇提物800 mg/(kg·d)，2次/d；吡拉西坦对照组灌胃600 mg/(kg·d), 2次/d；空白对照组和臭氧模型组灌胃 10 mL/kg生理盐水, 2次/d。除空白对照组小鼠外，其余各组小鼠分别置于体积为0.12 m3且开有通风孔的箱子中通入臭氧，臭氧发生器装置中的氧气流量定为0.4 m3/h。每隔1天通1次臭氧，每次25 min。给臭氧后，与空白对照组相比,臭氧模型组小鼠摄食量减少，体重明显降低，行动迟缓，精神萎靡，皮毛暗淡，眼睛颜色变深且浑浊无光，并偶有呼吸急促、全身颤栗、躁动不安的体征状况。且随给臭氧次数增加,表现愈加明显。14 d后，臭氧衰老模型建模成功。停止给臭氧、停止给药，断食给水24 h后进行学习行为能力测试和生化指标检测。

1.5 Morris水迷宫实验

Morris 水迷宫由圆水池(直径 80 cm，高30 cm，水深15 cm)和1个可移动位置的安全台组成，水温控制在(22±0.5)℃。水池内壁为黑色，水池周围用黑色不透光的幕布遮住，水面高出安全台表面0.5 cm，安全台表面为黑色，小鼠不能看到。将圆形水池分为四个象限，水池上方通过摄像机与监视电视连接，对动物活动进行全程跟踪。实验过程中水池及周围环境保持不变，供小鼠作为空间定位之用。

1.5.1定向游泳实验 用于测试小鼠对水迷宫学习能力。将安全台固定在第四象限，实验过程中位置保持不变。在水池上每个象限处标定一点作为每次小鼠的入水点，先后将小鼠从 4 个象限的入水点头朝池壁放入水中，每次以60 s为限，纪录小鼠从入水点到达安全台所需时间，以所需时间作为其学习和记忆的成绩。若小鼠在60 s 内仍未找到平台，计算机停止跟踪，将其引导至平台停留 30 s，记录时间为60 s。此为获得性实验， 2 次/d, 连续进行5天。记录小鼠寻找并爬上平台所需时间(逃避潜伏期)。

1.5.2空间探索实验 用于测量小鼠对平台空间位置记忆能力。在获得性实验结束后，隔1天，开始进行探查性实验。将安全台撤除后，随机选择1个入水点，将小鼠头朝池壁放入水池中，记录小鼠第1次到达安全台原位置所用的时间及穿越安全台的次数，以此作为其空间学习记忆的检测指标。

1.6 跳台实验

跳台实验是一次性刺激回避反应实验，能较客观地反映动物经过1次刺激后记忆获得的情况，尤其适用于药物筛选实验。将小鼠放入相互隔开的小室中，底面铺铜栅，可通电，内有5 cm高的绝缘平台作为回避电击安全区。设定电流为0.1 mA，当小鼠受到电击后，会躲避电击迅速跳上平台。跳上平台的小鼠可能会再次或多次跳下平台受到电击，电击后小鼠又会迅速跳回平台。如此训练5 min，并记录5 min内小鼠跳台次数。24 h后重新测试，此次测试条件不变，方法同上，记录5 min内小鼠的跳台次数，以此反映记忆保持的情况。

1.7 生化指标检测

跳台实验后，禁食不禁水。除空白对照组给生理盐水之外，其余各组小鼠再分别给臭氧、给药1次，24 h后摘眼球取血，离心制备血清。按试剂盒操作说明测定血清中MDA含量。

1.8 统计学分析

采用SPSS19.0 统计软件对实验数据进行单因素方差统计分析。计量数据用均数±标准差表示，组间比较采用采用方差分析，组间两两比较用LSD法。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1对臭氧衰老模型小鼠Morris 水迷宫实验的影响

2.1.1对定向游泳实验的影响 从D3开始，除臭氧模型组之外，各组小鼠整体出现潜伏期变短并趋于平稳的趋势，说明小鼠经过训练后获得记忆。与空白组比较，臭氧模型组D4(P<0.05)和D5(P<0.01)逃避潜伏期明显延长，说明本实验中臭氧模型建模成功；与臭氧模型组比较，迷迭香、吡拉西坦都能明显缩短逃避潜伏期(P<0.05，P<0.01)，说明迷迭香和吡拉西坦都能有效的改变臭氧模型小鼠的学习记忆能力，但是迷迭香醇提物不如吡拉西坦效果更显著,见表1。

表1 迷迭香醇提物对小鼠水迷宫逃避潜伏期的影响

2.1.2对空间探索实验的影响 与空白对照组比较，臭氧模型组小鼠首次找到安全台原位置的时间最长(P<0.05)，安全台穿越次数最少(P<0.05)；与臭氧模型组比较，迷迭香醇提物能减少小鼠找到安全台的时间，增加安全台穿越次数(均P<0.05)，但效果不及吡拉西坦(P<0.05，P<0.01)。见表2。

表2 迷迭香醇提物对小鼠水迷宫探查性实验的影响

与空白对照组比较，#P<0.05；与臭氧模型组相比，*P<0.05。

2.2对臭氧衰老模型小鼠跳台实验的影响

与空白对照组比较，臭氧模型组小鼠跳台错误次数明显增多(P<0.05)，说明模型组小鼠对于电击记忆差，大脑迟钝；迷迭香和吡拉西坦均能明显降低错误次(均P<0.05)。见图1。

表3 迷迭香醇提物对小鼠血清MDA的影响

2.3对臭氧衰老模型小鼠MDA的影响

与空白对照组相比较，臭氧模型组血清MDA含量显著升高(P<0.01)，提示臭氧损伤抗氧化系统，导致脂质过氧化。迷迭香和吡拉西坦均能显著降低血清MDA含量(均P<0.01)，效果相当。见表3。

3 讨 论

臭氧衰老小鼠模型是根据衰老自由基理论而设计的。作为一种强氧化剂，臭氧能与有机分子作用产生过量的自由基，影响生物活性，加速机体功能衰退，诱导衰老[5]。动物实验证明,臭氧能使胸腺及脾脏免疫器官萎缩,免疫反应下降[6],学习能力降低，在一定程度上模拟了阿尔茨海默病的发病特点。本研究结果显示，臭氧能使小鼠在形态、行为上明显出现衰老指征，在水迷宫及跳台实验中学习能力降低、空间记忆功能障碍，这与李军等人[7]报道的结果相一致。同时结果也表明吡拉西坦(脑复康)、迷迭香醇提物均能不同程度地改善臭氧衰老小鼠的自发活动和行为学表现，提高学习记忆功能。

研究表明，脂质过氧化作用在心血管疾病、老年病等进展过程中起着一定的作用。体内某些正常物质代谢过程及某些药物或毒物在体内代谢变化过程中生成的自由基,可引起脂质发生过氧化作用(LPO),其中间产物丙二醛(MDA)可使生物大分子破坏[8],因此, 测定血清MDA含量可了解体内脂质过氧化作用的程度,对于研究某些疾病及药物或毒物的作用非常有意义。本研究结果显示臭氧模型组小鼠血清MDA含量显著升高，而迷迭香能明显降低小鼠MDA含量，说明迷迭香醇提物能有效的抵御臭氧引起的脂质过氧化和自由基损伤。

本研究采用的迷迭香醇提物未经纯化和精制，内含多种有效活性成分，如：酚酸类、黄酮类等。因此不能确定具体是迷迭香中哪一种活性物质占主要作用，可能是多种成分的协同作用，也可能某些成分对其他成分起到拮抗作用。鉴于此，本研究经过几种不同浓度的平行预示实验后选取比吡拉西坦浓度[600 mg/(kg·d)]略大的迷迭香提取物浓度[800 mg/(kg·d)]作为灌胃浓度。目前关于迷迭香醇提物口服后在动物体内的代谢途径和代谢机制尚不清楚，但浓度相当的迷迭香醇提物能达到与吡拉西坦几乎相当的作用效果，可间接说明迷迭香醇提物口服吸收好，具有良好的药代动力学特性，对阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)有一定的治疗前景。