穿山龙总皂苷对脑缺血损伤大鼠的保护作用

杨璐平 刘方永 徐 凯 王荣荣 高红莉

山东第一医科大学(山东省医学科学院)1.药学院，2.运动医学与康复学院，山东 泰安 271016

穿山龙，其来源为薯蓣科多年生草本植物穿龙薯蓣DioscoreaNipponicaMakino的干燥根茎，为泰山道地药材之一，临床常用于风湿痹痛、跌扑损伤、咳嗽气喘等病证[1]。有研究表明穿山龙及其提取物有一定的抗脑缺血损伤作用[2-3]，但对其脑保护的作用机制尚未阐明。本实验通过MCAO大鼠模型，探讨穿山龙的主要有效成分穿山龙总皂苷的脑保护作用及其机制，以期对其脑血管方面的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

穿山龙购自泰安市永春堂中药饮片有限公司，经山东第一医科大学(山东省医学科学院)中药学教研室曲晓兰副教授鉴定其来源为穿龙薯蓣DioscoreaNipponicaMakino，用药部位为根茎。穿山龙总皂苷为山东第一医科大学(山东省医学科学院)中药学教研室提取，为棕色粉末，纯度为55.6%。尼莫地平片(20 mg/片，山东新华制药有限公司)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(Sigma公司)；苏木素-伊红染液(南京建成)，MMP-2兔多克隆抗体、HRP标记羊抗兔lgG(北京博奥森)，SOD、MDA试剂盒(南京建成)。

1.2 实验动物

SD大鼠购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，体质量200～240 g，共70只。均为雄鼠，SPF级，合格证号：SYXK(鲁)20140007。放置于SPF级实验室喂养，室温20～25 ℃，相对湿度35%～65%。

1.3 仪器

石蜡切片机(德国Leica)，IPP图像采集分析系统(美国Media Cybernetics公司)，紫外可见分光光度计(北京普析通用)。

1.4 MCAO大鼠模型制备与分组

适应喂养7 d后，大鼠随机分为5组：模型组、穿山龙总皂苷高剂量组(100 mg/kg)、穿山龙总皂苷低剂量组(50 mg/kg)、尼莫地平组(10 mg/kg)与假手术组。各组大鼠均是灌胃给予相应剂量的药物，造模前7 d开始给药，1次/d。等量生理盐水给予假手术组与模型组大鼠灌胃。

参照 Longa 等[4]的方法制备MCAO大鼠模型，末次给药1 h后水合氯醛( 350 mg/kg)ip麻醉大鼠。采用颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉(CCA)后找到颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA)，小心将三者分离。ECA的根部用丝线进行结扎，同时用动脉夹夹闭CCA的近心端，ICA也用动脉夹夹闭。用眼科剪在CCA远心端上剪一小口，插入前端处理成圆头的栓线，栓线直径为0.24～0.26 mm，栓线沿CCA，穿过ICA和ECA的分叉处插入ICA。松开ICA，栓线继续缓慢插入约1.8～2.0 cm，以微感阻力为止，结扎固定拴线。术中维持大鼠肛温为37 ℃。假手术组大鼠手术操作同上，只是栓线插入长度小于1 cm。大鼠清醒后参照Longa 5级4分制评分法[4]对各组进行神经功能评分，其中评为1～3分为造模成功，每组选取模型成功者12只纳入后续实验。

1.5 血清SOD及MDA指标的测定

大鼠进行神经功能评分后，取过量10%水合氯醛ip麻醉，腹主动脉取血5 mL，常规方法离心获得血清。按试剂盒说明书用紫外分光光度计测取其吸光度，计算血清SOD 活性及MDA含量。

1.6 脑梗死范围的测定

大鼠取血后，每组随机取6只，断头后完整剥离大脑，预冷的生理盐水冲洗干净。大脑去掉低位脑干、小脑和嗅球，-20 ℃速冻20 min。取出后将大脑沿冠状面平均切为6片，每片厚度2 mm。TTC制作成1%的染液，将脑片按顺序放入，置于37 ℃避光染色，10 min后翻面1次，继续染色10 min。脑组织染色后梗死部位呈现为白色，而正常组织则被染为红色。脑片经4%多聚甲醛固定后用扫描仪扫取图像。用IPP图像采集处理系统软件对图像进行处理分析，对脑片的梗死面积用软件进行测量，梗死体积为梗死面积乘以厚度。

1.7 脑组织病理形态学观察

每组另外6只大鼠4 ℃生理盐水心脏快速灌注，至右心耳流出液清澈时更换为4 ℃4%多聚甲醛继续灌注进行脑内固定，断头后完整取出大脑。按照常规方法进行脑组织石蜡切片制作。脑组织切片进行常规HE染色，显微镜下观察脑梗死部位神经细胞的形态变化，采集图像并进行分析。

1.8 脑组织MMP-2的蛋白表达检测

常规制作脑组织石蜡切片，微波抗原修复后，滴加1∶100稀释的MMP-2一抗，置于湿盒中4 ℃过夜。次日滴加HRP标记羊抗兔lgG，稀释比例为1∶50，37 ℃孵育30 min。切片用DAB显色，苏木素进行复染。切片经脱水、透明后封片。放置于光学显微镜下观察，以细胞质或细胞浆着色为棕黄色定为阳性细胞。每组随机选取8张切片，每张切片在400倍镜下选取缺血周边区典型的不重叠的5个视野，采集图像并用图像分析软件Image-Pro Plus 6.0测定阳性细胞率。

1.9 统计学分析

2 结 果

2.1 穿山龙总皂苷对MCAO大鼠神经功能评分、脑梗死体积的影响

神经功能评分结果显示，除假手术组外各组大鼠的神经功能评分均有所提高，特别是模型组大鼠的评分显著升高(P<0.01)，提示造模成功。与模型组相比，穿山龙总皂苷高剂量组(100 mg/kg)和尼莫地平组神经功能评分显著降低(P<0.01或P<0.05)。从TTC染色结果来看，穿山龙总皂苷高、低剂量组(100 mg/kg，50 mg/kg)均能减小脑梗死体积(P<0.01或P<0.05)。以上结果表明穿山龙总皂苷能降低MCAO大鼠的神经功能评分，缩小脑梗死范围。具体结果见表1。

表1 穿山龙总皂苷对MCAO大鼠神经功能评分、脑梗死体积的影响

2.2 穿山龙总皂苷对MCAO大鼠血清中MDA、SOD指标的影响

检测结果发现，模型组与假手术组有较大差异，血清中MDA含量显著升高，同时SOD活性明显降低(P<0.01)。与模型组相比，穿山龙总皂苷治疗组对MDA、SOD两个指标显示出较好的改善作用，其低剂量组能降低MDA含量(P<0.05)，而高剂量组能显著降低MDA含量同时升高SOD活性(P<0.01或P<0.05)。结果见表2。

表2 穿山龙总皂苷对MCAO大鼠血清MDA含量和SOD活性的影响

2.3 穿山龙总皂苷对MCAO大鼠脑组织病理形态的影响

HE染色结果发现，假手术组大鼠脑组织形态基本正常，模型组大鼠的脑组织细胞数量则显著下降，神经元出现变性、坏死，核固缩，部分核仁消失，胞体变形。与模型组相比，穿山龙总皂苷治疗组脑组织病理形态得到了不同程度的改善，其中高剂量组改善较为明显，见图1。

A.假手术组；B.模型组；C.穿山龙总皂苷高剂量组；D.穿山龙总皂苷低剂量组；E.尼莫地平对照组。图1 各组大鼠脑组织病理形态学观察(HE，×400)

2.4 穿山龙总皂苷对MCAO大鼠脑组织MMP-2蛋白表达的影响

模型组脑组织中MMP-2表达与假手术组相比显著升高(P<0.01)；与模型组比较，穿山龙总皂苷治疗组(100 mg/kg，50 mg/kg)的MMP-2蛋白表达均显著降低(P<0.01或P<0.05)，尼莫地平组表达也明显降低(P<0.05)。具体见表3、图2。

表3 穿山龙总皂苷对MCAO大鼠脑组织MMP-2蛋白表达的影响

A.假手术组；B.模型组；C.穿山龙总皂苷高剂量组；D.穿山龙总皂苷低剂量组；E.尼莫地平对照组。图2 各组免疫组化MMP-2蛋白表达(DAB，×400)

3 讨 论

缺血性脑血管病是脑血管疾病中最常见的类型，中医称为“中风”。缺血性脑血管病的发病比较复杂，其病理机制涉及多个因素，如氧化应激、炎症反应、Ca2+超载、兴奋性氨基酸毒性、细胞凋亡等等[5-6]，其中氧化应激、血脑屏障受损、细胞凋亡是其重要原因。

氧化应激是脑缺血损伤早期重要的损伤机制之一，内源性的抗氧化物质的耗竭会造成脑缺血损伤。脑缺血时，由于自由基的大量堆积和过度的脂质过氧化反应，导致大量MDA产生。过量MDA会导致膜结构以及功能的破坏，造成神经毒性损伤及神经功能障碍[7]。SOD的功能主要是参与消除氧自由基，它是机体重要的抗氧化酶，其作用是保护细胞，使其不受氧化性损害。SOD活性是反映机体清除自由基的能力的指标[8]，因此SOD和MDA在一定程度上可反映大脑损伤的轻重程度。在脑缺血早期，MMP-2也是造成缺血损伤的因素之一，研究表明，MMP-2参与了血脑屏障的破坏，从而加重脑水肿，使脑损伤加剧。脑缺血损伤时会产生大量氧自由基，而MMP-2等基质金属蛋白酶通过PTK(protein tyrosine kinase)依赖方式被活化，而MMPs的组织抑制剂同时被减少造成MMPs活化。活化的MMPs会造成紧密连接蛋白1的过度降解，血脑屏障受损，从而加重脑水肿[9]。缺血缺氧还可激活某些凋亡相关基因，同时大量氧自由基的产生对神经元造成损伤，可诱导凋亡的发生[10]。上述病理环节互相作用，最终导致细胞凋亡或坏死。

本研究结果显示穿山龙总皂苷可以降低MCAO大鼠的神经行为评分，减小脑梗死体积，改善脑组织病理形态，提示穿山龙总皂苷具有一定的脑保护作用。另外，穿山龙总皂苷可以提高MCAO大鼠血清中SOD活性同时降低MDA含量，降低脑组织中MMP-2的蛋白表达，因而推测穿山龙总皂苷的脑保护作用可能通过减少脂质过氧化产物同时提高抗氧化酶活性，调节血脑屏障减轻脑水肿而发挥作用，其详细的机制还有待进一步深入研究。