海藻寡糖生物肥对水稻产量及土壤菌群的影响

陈兴麟，刘 洋，罗土炎，王昌毓，杨海宁，曾润颖*

(1.自然资源部第三海洋研究所， 福建 厦门 361005; 2.福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所， 福建 福州 350001；3.宁波大学食品与药学学院， 浙江 宁波 315832)

亚洲是水稻的主要产销区，90%水稻生产和87%销售是在亚洲进行的[1]，中国是世界最大的水稻生产及销售国[2-3]。福建省是中国龙须菜生产大省，通过施用由龙须菜制备的有机海藻寡糖生物肥，实现福建省主要粮食作物水稻的提质增产，对推进福建省农药化肥零增长、减少农村面源污染有着重要意义。李娟等[4]通过832个水稻田间肥效试验，制定了福建省水稻氮磷钾施肥限量标准。在有限施用氮磷钾肥的条件下，通过将寡糖作为增效剂，进一步提升作物的产量，实现可持续耕作有重要意义[5]。吴家强等[6]发现施用海藻肥能加快水稻生长幅度，增强抗病性，增加株高，从而提高产量，增产幅度可达13.5%。李昉峻等[7]研究表明施用海藻糖能抑制水稻幼苗对镉的吸收，降低镉导致的叶绿素含量下降的幅度。与化肥相比，海藻肥富含氨基酸、天然植物激素前体物等多种高浓度活性物质，可以调节作物体内的激素和营养平衡，增强免疫力，促进作物增产增收，成为肥料制造领域的热门产品[8-9]。龙须菜可以吸收水体中的富余养分，抑制有害的赤潮微藻，回收后，还可进一步制备成土壤改良剂、生物燃料、生物肥料等[10-14]。用传统的方法从龙须菜中提取琼胶，会消耗大量的强酸、强碱，并产生难以利用的副产物藻渣，造成环境污染[15-16]。若进一步通过酸解法，将琼胶制备成寡糖，则会消耗额外的强酸，并且产物不均一[17-18]。按此工艺生产的海藻寡糖，从成本和品质上看，都无法满足农业用肥的需求。

本课题组利用深海原位富集的方法，从海水中分离得到细菌Flammeovirgasp.OC4，并通过菌株和龙须菜共培养的工艺，高效地获取海藻寡糖[19-21]。该工艺大大降低了成本，使原来多用于高端化妆品、保健品的海藻寡糖，有了更广泛的应用领域。其中，将该海藻寡糖与胶质芽孢杆菌Bacillusmucilaginosus001B复配成海藻寡糖生物肥，能使多种作物提质增产。在福建省南靖县，铁观音茶树喷施海藻寡糖生物肥可增产10.6%，并且茶叶的百芽重、维生素C、茶多酚等多个指标均有提高[22]。在重庆市酉阳县南腰界乡，喷施海藻寡糖生物肥的中华竹稻(聚两优746)，平均每667 m2增产24.3 kg，产投比达到2.6 ∶ 1[23]。前期研究表明海藻寡糖复配胶质芽孢杆菌的生物肥能够促进水稻提质增产，但各个成分的单独作用效果有待进一步研究。本研究以在南平地区广泛种植的甬优1540为试验对象，通过分别施用单一成分的肥料以及复合肥料，探讨肥料中各成分的作用机理。通过分析不同施肥水平下水稻产量、生理指标、根系土壤指标、微生物群落构成的差异，找出进一步优化海藻肥配方的依据，为水稻产业的减肥增效提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

胶质芽孢杆菌Bacillusmucilaginosus001B由本实验室前期从大田中分离得到。海藻寡糖是以深海细菌Flammeovirgasp.OC4发酵龙须菜制得，为新琼二糖、琼胶三糖、新琼四糖、琼胶五糖、新琼六糖的混合物。供试水稻品种为甬优1540。

1.2 田间试验设计

试验于2018年在政和县石屯镇松源村进行，海拔180 m，土质为砂壤土，肥力中等。水源条件好，排灌方便，前茬冬闲。试验田选择条件基本一致的连片田块进行，设置了4个处理，处理A(66.7%海藻寡糖+33.3%胶质芽孢杆菌)、处理B(100%海藻寡糖)、处理C(100%胶质芽孢杆菌)、CK(清水对照)，机耕方式。各处理不设重复，处理A面积3 773.52 m2；处理B面积3 873.53 m2；处理C面积3 386.84 m2；清水对照(CK)面积3 193.49 m2。

试验于6月15日播种，采用秧盘育秧，7月10日移栽，选用“久保田”六行机插秧，株行距30 cm×22 cm。每667 m2施51%复合肥30 kg作基肥，同时分别混入100 g各自类型的海藻寡糖微生物肥。此外，通过叶面肥形式增施3次海藻寡糖微生物肥(每667 m2施肥8 g)。第1次在8月3日水稻盛蘖时结合防治稻飞虱进行；第2次于8月18日结合防治稻飞虱、螟虫时喷施；第3次于9月25日齐穗时喷施。11月5日收获。

1.3 叶绿素相对含量的测定

于分蘖后期对各处理测定叶片叶绿素相对含量，选取主叶尖的下端10 cm处中间测量，每个处理测定100个数据。检测设备采用LYS-A型叶绿素测定仪(杭州绿博仪器有限公司)。

1.4 水稻产量及籽粒品质测定

于成熟期对各个处理以梅花型五点取样，每个样取1.11 m2测产量(参考用)；实际产量以实割实收过地磅计量为准。

将各处理的稻米，脱粒后混匀，根据(NY/T 2017-2011《植物中氮、磷、钾的测定》)、(NY/T 2420-2013《植株全钾含量的测定 火焰光度法》)测定稻米中的全氮、全磷、全钾。

1.5 土壤样品采集与理化指标测定

将各处理地块进行三等分，每个地块以梅花型五点取样获取水稻植株的根系土壤，混匀后作为1个样品。依照(NY/T 1121.2-2006《土壤pH的测定》)、(NY/T 1121.6-2006《土壤有机质的测定》)、(HJ 717-2014《土壤质量 全氮的测定 凯氏法》)、(HJ 632-2011《土壤总磷的测定 碱熔-钼锑抗分光光度法》)、(NY/T 87-1988《土壤全钾测定法》)、(LY/T 1228-2015《森林土壤氮的测定》)、(NY/T 1121.7-2014《土壤检测第7部分：土壤有效磷的测定》)、(NY/T 889-2004《土壤速效钾和缓效钾的测定》)、(NY/T 890-2004《土壤有效态锌、锰、铁、铜含量的测定 二乙三胺五乙酸(DTPA)浸提法》)、(NY/T 1121.13-2006《土壤检测 第13部分：土壤交换性钙和镁的测定》)，对土壤相关理化指标进行测定。

1.6 土壤DNA提取及高通量测序

采用OMEGA试剂盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit提取各土壤样本DNA，利用Qubit3.0 DNA检测试剂盒对基因组DNA精确定量。以定量的DNA为模板对菌群的V3～V4区进行PCR扩增，所用引物为融合了Miseq测序平台的引物，341F引物：(barcode) CCTACGGGNGGCWGCAG；805R引物：GACTACHVGGGTATCTAATCC。PCR采用30 μL反应体系，程序为：94℃预变性3 min；5个循环(94℃变性30 s，45℃退火20 s，65℃延伸30 s)；再20个循环(94℃变性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s)，然后，72℃延伸5 min。取20 ng的扩增产物作为模板，引入Illumina桥式PCR兼容引物进行第2轮扩增，程序为：95℃预变性3 min；5个循环(94℃变性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s)；然后，72℃延伸5 min。PCR产物进行琼脂糖电泳检测，利用磁珠(Agencourt AMPure XP)对DNA进行纯化回收，利用Qubit3.0 DNA检测试剂盒对回收的DNA精确定量，以20 pmol浓度上机测序[委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行高通量宏基因组微生物测序]。

1.7 数据处理

数据采用Excel、R、OriginPro 8.0等软件进行处理。

2 结果与讨论

2.1 不同施肥处理对水稻叶绿素的影响

水稻叶片的叶绿素含量高低与光合效率有较强的相关性[24]。如图1所示，处理B的叶绿素含量最高，其次是处理A。处理B为100%的海藻寡糖，处理A含66.7%的海藻寡糖，这说明肥料中的海藻寡糖可能有促进水稻叶片叶绿素合成的功能，在一定范围内，较高的浓度有较好的促合成效果。而肥料A的另一成分胶质芽孢杆菌对促进叶绿素合成的效果不明显。处理C(100% 胶质芽孢杆菌)与对照(CK)的叶绿素相对含量差别不显著。与对照(CK)相比，处理A和处理B的叶绿素含量增幅均超过17.37%。张运红等[25]研究发现增施海藻寡糖增效尿素能使水稻不同时期的叶绿素含量提高10.69%至19.58%。本研究的趋势与其相同，表明低分子量的海藻寡糖可增加水稻光合色素含量，提升水稻光合效率有着重要影响。

2.2 不同施肥处理对水稻产量的影响

根据实收产量测算，各处理的水稻每667 m2(下同)产量为523.1～592.2 kg(表1)。处理A的产量最高，为592.2 kg；处理C的产量次之，为580.0 kg；处理B的产量较低，为552.2 kg；清水对照(CK)的产量最低，为523.1 kg。结果表明，增施海藻寡糖或胶质芽孢杆菌对水稻都有增产作用，增产效果分别为5.6%、10.9%。而增施海藻寡糖和胶质芽孢杆菌的水稻，增产则达到13.2%，说明海藻寡糖和胶质芽孢杆菌对水稻的增产有着协同作用。有研究表明，对于同一种肥料，在不同时期进行叶面施肥，会导致水稻的增产或减产[26]。本试验尽管实现了增产，但进一步优化其复配比例，探究不同时期施肥的效果仍有意义。五点测产的结果略大于实收产量，但总体趋势不变，最高的单位面积产量仍是海藻寡糖和胶质芽孢杆菌复配的处理。

表1 不同施肥处理水稻产量比较

2.3 不同施肥处理对水稻籽粒的影响

研究表明在施氮量较高条件下，成熟期水稻籽粒中的氮浓度显著高于常规施氮处理[27]。本试验结果(表2)表明，增施100%海藻寡糖的处理B，水稻籽粒中的全氮和全磷含量最高，分别高于对照(CK)7.8%和6.3%，增施海藻寡糖和胶质芽孢杆菌复合肥的处理A，水稻籽粒中全钾的含量最高，高于对照(CK)25.0%。由于各处理增施的海藻寡糖生物肥均为少量的肥料增效剂，其施氮水平与对照一致，而籽粒中氮浓度高于对照(CK)，说明增施的海藻寡糖生物肥有利于水稻籽粒的物质积累，改善营养指标。

表2 不同施肥处理水稻籽粒的氮磷钾分析比较

2.4 不同施肥处理水平对根系土壤理化性质的影响

有研究表明，土壤pH值会影响早稻及晚稻品种的株高、镉含量、结实率、每穗实粒数、千粒重、单株产量等多个指标[28]。如表3所示，根系土壤pH最高的是处理B，为5.39；而最低的是处理A，为4.92。增施海藻寡糖生物肥的各个处理，其根系土壤的有机质含量均高于对照(CK)，全氮、全钾含量也均高于对照(CK)。而对照(CK)的根系土壤全磷含量最高，达到1.52 g·kg-1。

表3 不同施肥处理对根系土壤理化性质的影响

2.5 不同施肥处理根系土壤菌群差异分析

土壤微生物是土壤的重要组成部分，通过分析其根系微生物的多样性变化，可以判定施肥条件的效果[29-30]。高通量宏基因组微生物测序具有不受培养条件限制、快速、准确、数据量大等优点，已被广泛用于土壤微生物生态学研究[31]。如表4所示，本试验的12个样本的高通量测序共获得749 157条序列，经质量控制(QC)后，还有746 097条有效序列。原始序列的平均长度为455.61 bp，QC后则为415.43 bp。QC后，各样本的有效序列数在48 452条和82 161条之间，平均长度在412.95 bp和419.91 bp之间。测序深度满足进一步分析的要求。

表4 各样本高通量测序结果

样本聚类树图可以通过树枝结构直观地反映出多个样品间的相似性和差异关系。如图2所示，各处理的3个样本大都在同一分支，说明各处理的组间差异大于组内差异，添加海藻寡糖生物肥会导致根系土壤的微生物群落发生改变。而B1相对B2、B3的距离较远，可能是由于高通量测序时，有效序列数差异过大导致的。B1的有效序列数为71 773条，而B2、B3均未超过53 463条。值得注意的是，CK3的有效序列数(82 161条)也大大超过CK1(51 997条)和CK2(60 865条)，但在聚类分析中，尽管CK1和CK2在同一分支，它们与CK3的距离仍小于与其他处理的距离，因此，CK3和CK1、CK2仍在同一上级分支中。这说明了未施用海藻寡糖生物肥的根系土壤有更大的相似性。

Procrustes test(强制一致性检验)是检验两个矩阵相关关系的非参数统计方法，即使用简化的空间代替全部距离矩阵[32]。图3中不同颜色代表不同样本，样本间相似度越高则在图中越聚集。如图3所示，除了处理B外，其他各处理的各个样本相对聚集，说明不同处理对其土壤菌群的影响趋势较为一致。处理B与其他各处理之间的距离较大，该处理内各样本之间的距离也较大，可能是因为海藻寡糖能促进或者抑制根系土壤中某些微量菌群的生长，而起始状态下微小的菌群差异经长期的生态过程放大导致的。

进一步的菌群分析表明(图4)，Betaproteobacteria、Alphaproteobacteria、Deltaproteobacteria、Acidobacteria_Gp1、Acidobacteria_Gp3、Actinobacteria、Gammaproteobacteria为根系土壤的主要菌群。值得注意的是，在处理B中，Acidobacteria_Gp1和Acidobacteria_Gp3的相对含量明显低于其他各个处理。已有研究表明，土壤酸杆菌的相对丰度与土壤pH值呈显著的负相关[33-34]。而依照表2所示，处理B的pH值最高，因此其酸杆菌属的相对含量低于其他处理组。酸杆菌在土壤生态系统中可能起着降解植物残体多聚物、参与铁循环、光合作用以及单碳化合物代谢等重要作用[35]。

3 结论

3.1增施单一成分的海藻寡糖能增加水稻叶片的叶绿素相对含量，促进甬优1540增产。增施胶质芽孢杆菌虽不会增加叶绿素相对含量，但也能促进该水稻增产。两者混合增产效果更为显著，说明海藻寡糖与胶质芽孢杆菌之间存在混合增效作用。

3.2施用单一成分海藻寡糖的处理，其水稻根系土壤的pH值最高，且根系微生物的酸杆菌属明显低于其他处理组，该发现验证了“土壤酸杆菌的相对丰度与土壤pH值呈显著的负相关”的论断。

3.3本试验的海藻寡糖由微生物法制备，不影响其使用作物的有机认证。并且海藻寡糖生物肥可与杀虫剂混施，节省时间和降低人工成本。可以进一步优化产品配方，为更大面积水稻实现提质增收提供可靠的技术支持。