宏基因组学揭示鳗鲡养殖环境微生物抗性基因的赋存特征

黄 薇，廖 茜，罗土炎，宋永康*

(1.福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所/福建省农产品质量安全重点实验室，福建 福州 350003； 2.福建省食品药品质量检验研究院， 福建 福州 350005)

抗生素抗性基因(antibiotics resistance genes，ARGs)作为一种新型环境污染物，因其有自我扩增、容易转移给其他细胞等生物学特征，在2015年已被世界卫生组织(WHO)列为人类医疗健康面临的三大威胁之一。世界卫生组织(WHO)宣布将在全球范围内对控制ARGs进行战略部署[1]。目前，在水产养殖各种不同环境介质中(水体、土壤、沉积物)均有ARGs检出的报道，水产养殖场已经成为环境中ARGs的储存库[2-3]。作为一个水产养殖大国，在当前抗生素与ARGs污染日趋严峻的形势下，加强水产养殖环境中ARGs的污染情况研究力度已刻不容缓，也责无旁贷[4]。

传统检测环境ARGs的方法主要是通过ARGs的PCR、定量PCR以及耐药菌的培养筛选等，通过这些方法研究人员已经从不同环境介质中分离和鉴定了大量的ARGs，阐释了不同ARGs的作用机制[5]。但是，传统的研究分析方法具有一定的限制性，如大多的微生物不可培养、PCR结果的真实程度取决于设计引物的序列等，因此很难得到环境中微生物抗生素抗性基因组的全面和详细的信息。近年来，基于功能的宏基因组筛选和基于高通量测序为基础的宏基因组测序分析技术与方法的发展为研究环境抗生素抗性基因组的生态、起源、进化和传播机制提供了最强有力的工具[6-7]。Wang等[8]和Fang等[9]利用高通量宏基因组测序分析技术使人们对海水养殖场以及养猪场所蕴藏ARGs的种类、分布和传播途径都有了更进一步的理解。

鳗鲡Anguilla.sp是我国水产养殖出口创汇最多的品种之一，鳗鲡在人工养殖过程中疾病时有发生，其中细菌性疾病的危害最为严重，抗生素在养殖过程中被广泛使用。然而，直至目前国内外对鳗鲡养殖环境中ARGs的研究报道鲜见。因此，本研究选取鳗鲡养殖环境作为研究对象，运用高通量测序技术及功能宏基因组学分析方法，揭示在鳗鲡养殖环境中ARGs的污染现状与分布特征，以期为鳗鲡的健康养殖、病害防控以及水生态环境调控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2019年11月12日，选取三明市清流县的1个典型养鳗场作为采样点，在鳗鲡养殖场的3个养殖池分别收集底泥样品100 g、养殖水1 L，样品采集完毕后送实验室4℃保存，48 h内完成总基因组DNA提取。

1.2 基因组DNA提取

底泥样品分别取0.5 g采用PowerSoil DNA Isolation Kit试剂盒(MOBIO，Carlsbad，CA，USA)提取总基因组DNA；水体样品先采用5.0 μm滤膜过滤以去除浮游动物和浮游植物，再经过0.45 μm滤膜抽滤富集微生物。采用PowerWater DNA Isolation Kit试剂盒(MOBIO，Carlsbad，CA，USA)提取总基因组DNA；提取的DNA样品用Qubit 2.0 Fluorometer(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)进行定量，然后放置在-80℃下保存直至使用。

1.3 Illumina测序及高通量数据处理

为达到测序要求的DNA阈含量，分别将3个底泥和3个养殖水DNA样品等量混合成1个底泥混合样品和1个养殖水混合样品送上海美吉生物公司采用Illumina Hiseq 2500测序平台进行宏基因组测序。高通量测序原始数据先采用fastp软件进行质控去除接头序列、低质量碱基、N碱基及长度过短序列，利用Megahit与Newbler软件对质控数据进行多重混合拼接组装，使用MetaGene软件对拼接结果中的contigs进行ORF预测，采用CD-HIT软件进行聚类(默认参数为：95% identity、90% coverage)，每个类取最长的基因作为代表序列，构建非冗余基因集，使用BLASTP软件将非冗余基因集与NR数据库进行比对(比对参数设置期望值e-value为1e-5)，并通过NR库对应的分类学信息数据库获得物种注释结果，然后使用物种对应的基因丰度总和计算该物种的丰度，从而构建相应分类学水平上的丰度表，将数据上传ARDB数据库(http://ardb.cbcb.umd.edu/)进行比对(比对参数设置期望值e-value为1e-5)，获得基因对应的抗生素抗性功能注释信息。

2 结果与分析

2.1 高通量测序序列数据分析

鳗鲡养殖环境中底泥与养殖水的DNA样品经Illumina平台宏基因组测序共得到原始序列(Raw reads)42 935 336条和41 852 870条，质控后的有效序列(Clean reads)42 532 836条和41 257 260条，占原始序列的99.06%和98.58%，混合拼接后得到Contigs 512 773条和275 869条序列，N50分别为630 bp和1854 bp；经过基因预测得到ORFs的序列条数为642 119条和465 335条，通过聚类构建了837 326个基因的非冗余基因集。

2.2 鳗鲡养殖环境菌群结构和多样性分析

利用BLASTP将非冗余基因集与NR数据库比对进行物种分类注释，共得到131个门水平、268个纲水平、590个目水平、1 067个科水平、2 764个属水平和11 835个种水平的物种，其中注释为真细菌、古细菌、病毒、真核生物以及未分类物种的序列数分别占总注释序列数的96.88%、0.26%、1.24%、1.50%和0.12%。根据物种注释结果，生成物种门水平和属水平相对丰度柱形累加图(图1)。从图1a可知，鳗鲡养殖环境中底泥和养殖水的丰度最高的细菌门类为Proteobacteria，但优势菌群结构组成具有明显差异。在底泥中，优势群体的门类(相对丰度>5%)为Proteobacteria(48.72%)、Chloroflexi(8.85%)、Actinobacteria(8.17%)、Cyanobacteria(8.01%)、Gemmatimonadetes(6.56%)和Bacteroidetes(6.28%)；而在养殖水中，优势门类为Proteobacteria(51.37%)、Bacteroidetes(32.44%)和Verrucomicrobia(6.52%)。从图1b可知，在属水平下，底泥中相对丰度在2%以上的细菌属主要有Gemmatimonas(5.38%)、Rhodopseudomonas(3.23%)、unclassified_d_Bacteria(2.24%)、Oscillochloris(2.08%)和Methylibium(2.04%)，而养殖水的优势菌属为Limnohabitans(12.00%)、Novosphingobium(6.29%)、Rhodobacter(4.98%)、Sediminibacterium(4.22%)、Haloferula(3.11%)、Haliscomenobacter(2.74%)、Flavobacterium(2.39%)、Emticicia(2.29%)和Acidovorax(2.25%)。

2.3 鳗鲡养殖环境微生物基因组抗性基因分析结果

将鳗鲡养殖环境中底泥和养殖水的基因组数据上传ARDB抗性基因数据库进行ARGs的预测和注释，底泥和养殖水分别注释得到ARGs序列6 570条和19 356条，对鳗鲡养殖环境中的抗性基因类型进行统计分析(表1)。从表1可知，底泥的ARGs数量比养殖水低，但ARGs种类比养殖水高。同时，在养殖环境介质(底泥和养殖水)中的丰度较高的抗性类型均为四环素类、杆菌肽类和磺胺类抗生素，表明在鳗鲡养殖过程中，出现耐四环素、杆菌类以及磺胺类病原菌的机会相对较高。

在底泥中，共存在ARGs基因38种，归属于10类抗性类型。具体包括11种多重耐药基因、2种链霉素类ARGs、1种杆菌肽类ARGs、1种青霉素类ARGs、4种氯霉素类ARGs、2种甲氧苄啶类ARGs、1种红霉素类ARGs、1种氟喹诺酮类ARGs、2种磺胺类ARGs和13种四环素类ARGs。其中，丰度最高的抗性基因类型为四环素类、杆菌肽类和磺胺类抗生素，分别占底泥ARGs序列数的32.48%、27.00%和23.23%。在养殖水中，共存在9类29种ARGs基因抗性类型。具体包括7种多重耐药基因、2种链霉素类ARGs、1种杆菌肽类ARGs、1种青霉素类ARGs、3种氯霉素类ARGs、3种甲氧苄啶类ARGs、1种红霉素类ARGs、2种磺胺类ARGs和9种四环素类ARGs。其中，丰度最高的抗性基因类型同样为四环素类、磺胺类和杆菌肽类抗生素，分别占养殖水ARGs序列数的31.44%、31.28%和22.30%。统计结果表明，鳗鲡养殖环境微生物中存在种类多样且丰富的ARGs库。

表1 鳗鲡养殖环境微生物基因组中注释的抗生素抗性基因

3 讨论

宏基因组测序方法不仅可以检测ARGs的广谱特征，同时还能检测出环境微生物群落结构组成。从检测结果可知，鳗鲡养殖水中的优势菌群门类为Proteobacteria、Bacteroidetes和Verrucomicrobia，这与项目组之前对鳗鲡肠道优势菌群的研究结果相似[10]，说明养殖水体与养殖水生物之间的微生物存在相互作用和相互影响。不同菌种携带ARGs的偏好性不同，环境ARGs的种类与丰度和细菌群落结构组成密切相关[7，11]。本研究下一步拟利用宏基因组测序方式对鳗鲡养殖环境中微生物群落与ARGs之间是否存在着连锁效应、协同选择和进化的关系进行分析。

从ARGs注释结果可知，本研究共在鳗鲡养殖环境中共检测出39种ARGs，发现了许多未曾在鳗鲡养殖环境中报道过的ARGs，如emrf、smee等。导致这些基因未曾报道的原因可能是由于这些基因的宿主(耐药菌)难以培养或者是用于扩增这些基因的引物难以设计，这也进一步说明宏基因组测序分析方法比传统方法更能全面地检测出样品中的ARGs[12]。在鳗鲡养殖环境中，本研究检测出了禁限用已久的抗生素——氯霉素类ARGs，说明历史背景诱导产生的ARGs能够在环境中长期稳定的存在[13]。

在鳗鲡养殖底泥和养殖水中，丰度最高的抗性类型均为四环素类、杆菌肽类和磺胺类抗生素。这可能与鳗鲡养殖过程抗生素的使用方式及用途有关，抗生素残留造成的环境选择压力与抗生素抗性的产生密切相关[14]。在鳗鲡养殖过程中，土霉素常用于鳗鲡开口料——红虫的杀菌与消毒；杆菌类抗生素对水产动物具有促生长增重作用，提高饲料转化率的效果，常常作为饲料添加剂广泛使用；磺胺类抗生素常被用于治疗鳗鲡细菌型疾病。同时，在鳗鲡养殖环境中，还检测出丰度较高、种类繁多的多重耐药基因，可能与鳗鲡环境中使用的多种抗生素造成的微生物选择压力或者细菌之间ARGs的交换有关[15]。本研究采用宏基因组测序分析技术明确了鳗鲡养殖环境中ARGs的污染特征，可以为指导鳗鲡养殖抗菌药物的监管提供必要的参考依据，对水产动物源病害防控具有重要的应用价值，同时也表明宏基因组测序技术检测ARGs具有的可行性和优越性。