动脉粥样硬化相关血清生物化学及分子生物学检测指标的最新研究进展

马苑真,董 莉（内蒙古医科大学附属医院检验科，呼和浩特 010050）

1 动脉粥样硬化

动脉粥样硬化(atherosclerosis， AS)是一种人群中发病率很高的疾病，严重危害人群健康。传统的AS 实验室检测包括血脂及载脂蛋白的测定，只能评估AS 的危险因素，特异度较差。随着研究的深入和检验技术的发展，研究人员根据AS 的多种致病学说发现许多新的血清学检测指标可以指导临床诊断治疗AS。本文就几项新发现的与AS 相关的血清生物化学及分子生物学检测指标的致病机制及应用前景进行综述，为将来AS 的定性检测及靶向治疗提供理论依据。

2 动脉粥样硬化相关的血清生物化学及分子生物学检测指标

2.1 S100 钙结合蛋白 S100 钙结合蛋白（S100 calcium binding protein，S100）是1965年在牛脑中提取出来的一类神经蛋白质，是钙结合蛋白中最大的亚族，现发现共有24 个组成成员，包括S100A1～16，S100B，S100P，S100Z，CALB 等[1]。其中S100A8 和A9 主要由活化或坏死的中性粒细胞和单核巨噬细胞释放产生，在体内或体外多以异二聚体的形式存在[3-4]。S100 钙结合蛋白可以与多种配体结合，包括晚期糖基化终产物(receptor foradvanced glycation end products, RAGE) 受 体，Toll样受体4(toll-like receptor,TLR-4)，高级糖基化终产物( advanced glycation end products, AGEs)，膜联蛋白A2 和p53 等，参与炎症反应、氧化应激和细胞凋亡等生物活动[2]。

研究发现，高浓度的S100A8 和A9通过RAGE 受体触发下游信号包括丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)，磷酸肌醇3- 激酶(phosphoinositol 3-kinase，PI3K)，Rho GTP 酶(Rho-GTPase)，细胞分裂周期蛋白42(cell division cycle42, CDC42)， 小GTP 结合蛋白(rac family small GTPase 1，RAC1), 非受体酪氨酸激酶/信号转导子和转录激活因子(janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)及转录激活蛋白-1(activator protein1,AP-1)，可以激活核因子(nuclear factor，NF-κB）、血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1） 和单核细胞趋化蛋白（monocyte chemoattractant protien-1，MCP-1），增强中性粒细胞和单核细胞的募集和活化，促进动脉粥样硬化的形成[5]。S100A8 和A9 的高表达还可以导致AGEs增加，而AGEs 可以与RAGE 结合促使巨噬细胞迁移增加，参与炎症反应，促进粥样硬化的发展[6]。多个实验还证实S100A8 和A9 可以通过TLR-4 诱导增加细胞因子、趋化因子和肿瘤坏死因子等炎症因子的分泌，[7-8]TLR-4 的激活还可以增加S100A8，S100A9，S100A12，IL-1 和干扰素的表达，此双向促进作用可以进一步放大炎症反应促进粥样斑块的形成，而S100A12 还与动脉钙化呈正相关[9]。由此可见，S100A8/A9 主要通过RAGE 和TLR-4受体促进AS 形成过程中的炎症反应，有望成为新的血清学指标辅助诊断动脉粥样硬化。

2.2 小分子RNA(miRNA) 小分子RNA(miRNA)是一类存在于真核生物中长度约21～23 个核苷酸的非编码RNA，可以与mRNA 结合抑制转录后基因的表达影响生物合成。一个miRNA 可以或强或弱的与多个mRNA 的靶点相结合调控转录及其稳定性，一个mRNA 也同时受到多种miRNA 的调控，可见miRNA 可以广泛参与各种生物活动，对生物体的生长发育发挥着至关重要的作用。现已发现人体中存在2 000 多种miRNA[10],且有多种miRNA 被证实与动脉粥样硬化的发生发展相关。

2.2.1 microRNA-21 研究发现microRNA-21 与冠状动脉疾病患者（coronary artery diseases, CAD）斑块的稳定性呈正相关[11]，缺乏miR-21 的巨噬细胞其蛋白激酶（MKK3）基因过表达，促进p38-CHOP 和JNK 信号通路，使调节巨噬细胞内胆固醇外排的转运蛋白ATP 结合盒转运体G1 (ATP-binding cassette sub-family G member 1，ABCG1）发 生 降解影响泡沫细胞的形成[12]。miR-21 的过表达可显著抑制炎性细胞因子IL-6 的分泌，还可以对TLR4的抗体以及NF-κB 的抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(ammonium pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)进行前处理，负向调控巨噬细胞中脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的脂质沉积和炎症反应[13]， 对粥样斑块起到一定的保护作用。

2.2.2 microRNA-126 WU 等[14]人的研究中发现miR-126 与CAD 患者的炎症细胞因子[包括肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF-α),细胞间黏附分子-1 (intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)，CRP 及IL-6]呈负相关，可以预测CAD 患者的严重程度。miR-126 主要参与调节血管的生成，在成熟的血管内皮细胞及成人的血管内皮祖细胞中，它可以抑制增生，维持血管内皮和血流微环境的稳定[15]。研究发现miR-126 类似物可以通过抑制PI3K/Akt/mTOR 通路来恢复自噬流，从而减轻氧化修饰低密度脂蛋白（oxidation modifies LDL，ox-LDL）对人脐静脉血管内皮细胞的损伤，可以作为逆转动脉粥样硬化潜在的治疗靶点[16]。

2.2.3 microRNA-155 LI 等[17]人研究发现动脉粥样硬化患者的血清及粥样斑块中的miR-155 表达明显升高，TNF-α 可以通过激活核因子NF-κB 转录上调miR-155，高表达的miR-155 通过钙调节热稳定蛋白1（calcium regulates heat stable protein 1 ，CARHSP1）负反馈下调TNF-α，从而抑制巨噬细胞的炎症反应，研究还发现伴有miR-155 高表达的肥胖个体与缺乏miR-155 的单纯肥胖个体相比较，更容易发生AS[18]。由此可见粥样斑块形成过程中可以伴随miR-155 的高表达，而过量的miR-155 又可以负反馈抑制炎症反应。

综上所述miR-21，miR-126 和miR-155 影响AS过程中泡沫细胞的形成、脂质沉积和炎症反应等机制 ，可以作为新的检测指标评估AS 的危险程度，其中miR-126 还有望作为一种新的治疗靶点逆转粥样斑块。除此之外目前人类发现与AS 相关的micro-RNA 还有很多种，包括miR-146，miR-145，miR-19，miR-195，miR-221/222，miR-10a 和let-7 家族等，将来可以为临床指导AS 诊疗提供新的途径[18]。

2.3 基质金属蛋白酶 基质金属蛋白酶(metallomatrix proteases， MMPs）是内皮细胞和平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)产生可以降解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)促进内皮细胞和血管平滑肌细胞增殖和迁移的蛋白水解酶，其活性受“金属基质蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloprotenase，TIMPs)”的调节，可以参与动脉粥样硬化性病变、动脉重塑及心肌修复等过程[19]。MMPs 包括有MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-12 和MT1-MMP，它们可以通过调节血管内皮生长因子及其受体(vascular endothelial growth factor-vascular endothelial growth factorreceptor, VEGF-VEGFR)以及细胞-细胞黏附信号等因子使蛋白质和其他非细胞外基质发生水解，参与血管形成和重塑。

研究发现MMP-9 浓度在稳定的动脉粥样硬化患者血清中显著高于正常对照组[20]，同时还有研究表明丙烯醛可以通过MAPK 途径上调MMP-9，从而影响动脉粥样硬化相关的肠道菌群[21]。最新研究发现MMP- 9 在冠心病患者中发生急性动脉粥样硬化血栓性心肌梗死时明显升高，但在静止期随访无明显差异[22]。且有报道称国外MMP-9 已经在临床中用于对易损斑块的检测[23]。由此可见MMP-9 在稳定的冠心病患者中其应用价值尚存在争议，但可以作为检测指标评估动脉粥样硬化患者发生急性心肌梗死的风险。

2.4 微粒 微粒（micropariticles, MPs）是一种膜脱落的细胞外囊泡，直径在100～1 000nm 之间，存在于组织及体液（血液、滑膜液和唾液等）中，由细胞活化或凋亡时产生，MPs 可以运输活化后的脂质，可编码RNA，microRNA，长非编码RNA 和DNA等信号，作用于靶细胞的膜受体和胞质受体，被认为是细胞间通讯的生物媒介[24]。实验发现内皮细胞来源的MPs（EMPs）及血小板来源的MPs(PMPs)均与动脉粥样硬化的多种致病机制相关[25]。在促凝血方面，MPs 富含磷脂酰丝氨酸（PS）等信号分子可以激活促凝血因子TF，通过TF 的促凝血功能促进AS 的形成。在血管生成方面，EMPs 传递miR-126还可以使miR-126 的靶蛋白低密度脂蛋白受体相关蛋白6（LDL receptor associated protein 6, LRP6)表达降低,调节血管平滑肌的增殖和迁移以及新生内膜的形成[26]。在内皮功能方面，EMPs 通过抑制Akt 蛋白质分子和内皮型一氧化氮合酶-热休克蛋白90（Akt and endothelial nitric oxide synthase -heat shock protein 90, Akt/eNOS-Hsp90)导致内皮细胞NO 生成减少影响血管舒张[27]。在炎症方面，MPs 可以通过JUN 蛋白氨基末端激酶1(JUN protein amino-terminal kinase 1, JNK1)和NF-κB 通路上调炎症因子的表达，如IL-6，单核细胞趋化蛋白（monocyte chemoattractant protein 1, MCP-1）、 一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,iNOS）和环氧合酶-2 (cyclooxygenase-2, COX-2)。血小板来源的MPs 可以分泌花生四烯酸，通过蛋白激酶C (protein kinase C，PKC)增加内皮细胞中COX-2 和ICAM-1 的释放[28]。除此之外，还有研究发现在体外培养人脐静脉内皮细胞分泌的MPs表面还表达与AS 相关的MMP-2 和MMP-9。

ZABORO-WSKI 等人发现在急性冠脉综合征（acute coronary syndrome，ACS）患者中，具有促凝功能的内皮来源的MPs（EMPs）其血清水平会明显高于健康人群，且高水平的EMPs 能促进冠脉内血栓的形成[24]。经过调查发现，在ACS 患者组的MPs 水平明显高于稳定性心绞痛组（stable angina，SA）患者，MPs 水平对于稳定的AS 患者无太大影响。由此可见MPs 可以通过促进凝血，增加炎症反应，影响血管形成及内皮功能等多种机制参与动脉粥样斑块的形成过程，其中EMPs 对动脉粥样硬化的影响作用更为明确，有望作为检测指标评估动脉粥样硬化患者发生急性冠脉事件的危险程度。

2.5 白细胞介素-33 白细胞介素-33(interleukin-33, IL-33)是IL-1 家族的一员，当细胞发生损伤或坏死后被释放，作为一种损伤相关分子与生长刺激表达基因2 蛋白(growth stimulation expressed gene 2,ST2)结合参与动脉粥样硬化、心肌纤维化和心室重构等过程[29-30]。研究表明IL-33 主要参与TH2 相关的免疫反应，同时还可以促进自然杀伤细胞分泌γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)，增强肥大细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的黏附能力以及促进该类细胞释放细胞因子，还可以促进巨噬细胞分泌TNF-α, IL-6 和IL-1β[31]参与免疫炎症反应。并有报道指出IL-33 还可以促进EMPs 增加其表面TF 相关信号的表达，共同参与动脉粥样硬化的形成过程[32]。

有研究提出β 受体阻滞剂在治疗心室重构过程中可能是通过IL-33/ST2 信号通路的调节起到有益的作用[30]。目前研究发现IL-33/ST2 在心衰患者的心肌组织中高表达，其表达量与心肌纤维化和促纤维化的信号蛋白包括结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF) 和转化生长因子β1 (transforming growth factor factorβ1，TGFβ1) 具有相关性，提示IL-33/ST2 具有促进心肌纤维化的作用[33]。STANKOVIC A 等[34]人发现颈内动脉粥样斑块切除术(carotid endarterectomy ，CEA)患者IL-33血清水平、sST2 血清水平明显高于健康对照组，通过大量数据证明IL-33/ST2 与动脉粥样硬化的发生具有相关性，并提出IL-33 可能作为促炎因子来促进粥样斑块病变的发展促进病变血管的纤维化。还有部分研究表明在PCI 术后患者中，IL-33 血清水平的增加与支架内再狭窄的高发病率有关。可见IL-33可以通过促进纤维化，增加炎症反应等机制促进动脉粥样硬化过程，将来有望作为血清检测指标提示AS 病变程度及支架内再狭窄的发生风险。

3 展望

动脉粥样硬化在人群中的发病率较高而且并发症种类多、危害大，严重影响人类的健康。目前，AS 的诊断仅凭影像学来完成，血清标记物的测定仅限于科研，且为单项研究。与传统影像学相比，血清检测具有无创、可批量等优点，还可以根据相应的检测指标进行早期干预减少并发症的产生。为达到这一目标，就要求我们发现越来越多新的与动脉粥样硬化相关的血清学指标，着力于寻找一种特异性较强的指标或几种指标联合预测动脉粥样硬化病变发展情况，提高其诊断的灵敏度和特异度，同时还可以根据其在粥样斑块的发生发展过程中的作用研发新的靶点，为精准治疗提供理论依据。