沈 玲,白 欢,李 丽,汪 玥,龚 路,孙自镛,陈中举
(华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科,武汉 430030)
近些年来,微生物检验新技术不断出现,包括GeneXpert/FilmArray、基因芯片检测、高通量测序技术(NGS)、MALDI-TOF MS 等。MALDI-TOF MS,即基质辅助激光解析电离飞行时间质谱,通过检测待检病原菌株蛋白以获取其质谱峰结果,同时对比庞大的菌株数据库内标准菌株的蛋白质谱峰图谱,从而实现对待测菌株的鉴定[1]。与传统微生物鉴定方法相比,MALDI-TOF MS 具有操作简单、快速、灵敏度高、准确度好、高分辨率等优势,从而逐渐进入临床微生物实验室[2],基于此,目前市面出现了诸多品牌的MALDI-TOF MS 质谱分析系统,郑州安图生物工程股份有限公司生产的型号为Autof MS1000 质谱鉴定系统便为其一,然而其仪器性能如何,是否可在临床实验室广泛推广,在国内尚无报道。本研究旨在评价Autof MS1000 质谱鉴定系统在临床常见病原菌中的鉴定能力,从而为其能否在临床微生物实验室广泛应用提供依据。
1.1 菌株来源
1.1.1 准确度评估:选取华中科技大学同济医学院附属同济医院2018年6月~2019年6月231 株能够涵盖实验室80%~90%的常见分离菌株和1 株室间质控菌株(国家卫健委临床检验中心1705 二路普雷沃菌,厌氧菌属)作为检测标本,其中革兰氏阳性需氧菌77 株,革兰氏阴性需氧菌95 株,厌氧菌30 株,酵母样真菌30 株。
1.1.2 精密度评估:选取ATCC25922 大肠埃希菌等12 株室内质控菌株和临床分离菌株作为检测标本,其中革兰氏阳性需氧菌4 株,革兰氏阴性需氧菌6 株,酵母样真菌2 株。
1.2 主要仪器及试剂 德国布鲁克公司质谱鉴定系统IVD MALDI BIOTYPER 及其配套试剂;郑州安图生物工程股份有限公司Autof MS1000 全自动微生物质谱检测系统及其配套试剂;美国伯乐公司核糖体16S RNA 测序仪及其配套试剂。
1.3 方法
1.3.1 菌株鉴定方法:
1.3.1.1 Bruker MALDI-TOF 质谱鉴定系统鉴定:取冻存菌株传代两代至哥伦比亚血平板或临床分离菌株细菌均匀点种在靶板各个孔位内,使用直接涂布法或是甲酸涂布法按照仪器操作手册操作。
1.3.1.2 Autof MS1000 质谱鉴定系统鉴定:取冻存菌株传代两代至哥伦比亚血平板或临床分离菌株细菌均匀点种在靶板各个孔位内,使用直接涂布法或是甲酸涂布法按照仪器操作手册操作。
1.3.1.3 核糖体16s RNA 测序:取临床菌量1ml,采用煮沸法进行DNA 提取; 以引物PSL,UNI 进行宽范围PCR 扩增16s rRNA(真菌需要把its 区域保守序列扩增);PCR 产物纯化;上机测序,测序仪器:ABI 公司的3500Dx。
1.3.2 仪器评估方法
1.3.2.1 准确度评估:标准菌株和质评菌株为已检测菌株,临床分离菌株已经实验室现有鉴定设备Bruker MALDI-TOF 进行检测。对上述已检测菌株在Autof MS1000 质谱鉴定系统进行鉴定,评价Autof MS1000 鉴定结果与Bruker MALDI-TOF鉴定结果的符合性。鉴定可以是属的水平或种的水平,但对于关键微生物(如,肺炎链球菌),鉴定到种是至关重要的。有差异鉴定结果的分离株应使用当前的Bruker MALDI-TOF 和待评价系统(Autof MS1000)进行重新检测,若依然存在差异则采用第三种方法(核糖体16s RNA 测序)进行确认。
1.3.2.2 精密度评估:选取ATCC25922 大肠埃希菌等12 株菌在Autof MS1000 质谱鉴定系统上进行重复性测试,每株菌重复检测3 次。
1.3.3 结果判读:依据CLSI M52 对商业化微生物鉴定系统(MIS)验证的建议,准确度超出90%,精密度超过95%即被认定为通过[3]。
2.1 准确度评估 共纳入232 株菌株,其中77 株革兰氏阳性需氧菌,其中包括葡萄球菌属20 株,肠球菌属18 株,链球菌属37 株,其他2 株(棒杆菌属1 株,李斯特氏菌属1 株);95 株革兰氏阴性需氧菌,其中包括肠杆菌属46 株,假单胞菌属7 株,不动杆菌属16 株,莫拉菌属5 株,嗜血杆菌属2 株,气单胞菌属4 株,伯克霍尔德菌属3 株,木糖氧化无色小杆菌3 株,嗜麦芽寡养单胞菌4 株,其他5株(速生短杆菌1 株,中间苍白杆菌1 株,脑膜脓毒伊金氏菌1 株,分散泛菌2 株);30 株厌氧菌,其中包括梭菌属9 株,拟杆菌属12 株,普雷沃菌属2 株,大芬戈尔德菌2 株,迟缓艾格特菌2 株,其它3 株(小韦荣氏球菌1 株,龋齿放线菌1 株,海氏嗜胨菌1 株);30 株酵母菌。其鉴定符合率为100%,即准确度为100%。因鉴定结果均一致,故未使用到测序方法做确证试验。
2.2 精密度评估 选取ATCC25922 ECO*,ATCC49247 HIN,A190609196 PAE,ATCC25923 SAU,ATCC22019 CPA,B190608252 SAU,ATCC27853 PAE,A190609045 ECO*,A190607291 SPN**,ATCC49619 SPN**,A190608193 ABA 和F190610024 CAL(*为大肠埃希菌/志贺菌不能区分的结果加做吲哚试验进一步确认为大肠埃希菌,**为肺炎链球菌需经奥普托欣试验作进一步确认)等12 株室内质控菌株和临床分离菌株进行重复性测试,每株菌检测的重复性结果均为100%,即精密度为100%。
MALDI-TOF MS 质谱分析技术近年来发展迅速,在临床微生物鉴定领域,凭借其高通量、试剂成本低、操作简单、使用菌量少,且可鉴定出某些传统鉴定方法鉴定菌株种属困难的优势,而迅速走红临床微生物实验室,大有取代传统微生物鉴定方法之趋势[2]。
郑州安图生物工程股份有限公司生产的型号为Autof MS1000 的全自动微生物质谱检测系统基于MALDI-TOF MS 质谱分析技术,主要用于细菌、酵母样菌、丝状真菌、分枝杆菌等菌株的检测,具有MALDI-TOF MS 技术快速、准确、高通量等特点,同时拥有超过2 000 菌种数据的中国本土化数据库,然而其仪器实际性能如何,是否可在临床微生物实验室广泛使用,国内尚无相关报道。鉴于此,对Autof MS1000 全自动微生物质谱检测系统作出适宜的仪器性能评估显得尤为重要。本研究主要从仪器性能的准确度和精密度两个最重要的方面来对Autof MS1000 全自动微生物质谱检测系统在临床微生物实验室中常见病原菌鉴定能力的评估。BESSÈDE 等[4]使用MALDI TOF MS 鉴定了1 013 株细菌,其中986 株菌被准确鉴定到种水平,其种水平鉴定准确度为97.3%;SENG等[5]运用MALDI-TOF MS 鉴定了1 660 株菌,其中84.1%准确鉴定到种水平,另11.3%准确鉴定到属水平,总体鉴定准确度为95.4%。在本研究中,Autof MS1000 总体鉴定准确度达100%,精密度达100%,性能指标明显优于国外相关的研究数据,评估结果符合CLSI M52 对商业化微生物鉴定系统(MIS)验证建议的要求[3],亦满足临床微生物实验室对微生物鉴定的需求,建议可在临床微生物实验室推广使用。但由于本研究中纳入评估的菌株数量有限,且基本为实验室常见菌株,后续需进一步纳入大样本、罕见菌以对仪器作出更加全面可靠的性能评估。另外值得特别注意的是,由于MALDI- TOF MS 技术本身的局限性,对于一些近缘种及亚种不能进行有效的区分[6],如在本研究中,大肠埃希菌/志贺菌不能区分的结果需加做吲哚试验进一
步确认为大肠埃希菌,肺炎链球菌需经奥普托欣试验作进一步确认,实验室需充分了解其局限后,在必要时采用适当的补充实验以作进一步的区分。除病原微生物菌种鉴定领域外,随着MALDI -TOF MS 技术的不断发展,其在细菌耐药性方面亦取得诸多新的成果[7],质谱分析技术在临床微生物实验室的应用前景值得期待。