TGF-β信号通路在食管癌中的作用

阮豪杰，许海军，陈 攀，闫锦阳，高社干

在哺乳动物中，转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)信号通路能够影响细胞分化、增殖、迁移、细胞外基质重塑、凋亡等多种生物学过程，参与胚胎发生、免疫调节、纤维化、伤口愈合、肿瘤进展等发育及病理学反应[1]。全世界每年确诊的食管癌患者约为45万人，死亡率在所有癌症中位居第六位[2]。食管癌主要有两种组织学亚型：食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)，每种亚型均具有已知的危险因素和病理特征。ESCC占全世界食管癌病例的90%，但某些地区EAC的发病率正在上升，甚至超过了ESCC[3]。尽管最近在食管癌的诊断和治疗方面取得了进展，但食管癌的预后仍然很差，5 a生存率约为15%～25%，主要是由于晚期食管癌已发生转移才被确诊[2]。因此有必要更好地了解食管癌的分子发病机制，以开发新的生物标志物和靶向治疗方法。

1 TGF-β的激活及其受体

TGF-β超家族包括至少40个结构和功能相关的细胞因子，这些细胞因子参与胚胎发育、细胞外基质形成、免疫调节、炎症、癌症等多种生物学过程[4]。TGF-β激活的方式复杂多样。首先，与TGF-β结合的延迟相关肽(latency-associated peptides,LAPs)在凝血酶素-1(thrombospondin-1,TSP-1)作用下构象发生变化[5]，随后在转化酶、血纤维蛋白溶酶、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)等酶的共同作用下，TGF-β游离而激活[6]；其次，低pH水平的局部微环境或照射引起的活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生可以激活TGF-β[7]；另外，肌成纤维细胞的机械收缩可以进一步激活潜在的TGF-β。上述这些机制导致具有生物活性的TGF-β释放，从而结合TGF-β受体和下游信号分子激活。TGF-β家族蛋白根据结构特征可分为多种亚型，包括TGF-β、激活素/抑制素、骨形态发生蛋白/生长分化因子[8]。TGF-β受体传导信号包括TGF-β RⅠ、TGF-β RⅡ和TGF-β RⅢ。在大多数组织中，TGF-β受体通过两个TGF-β RⅠs和两个TGF-β RⅡs形成异四聚体复合物来起作用[9]。

2 Smad依赖性的信号通路

TGF-β的信号传导依赖于Smad蛋白家族。活性TGF-βⅠ与细胞表面的TGF-β RⅡ结合激活TGF-β RⅠ，进而使Smads(R-Smads)磷酸化。R-Smads包括Smad2和Smad3、R-Smad和Co-Smad分子在蛋白质的氨基端和羧基端有两个保守的结构域，即MH1和MH2结构域、MH1和MH2结构域之间包含一个连接区结构域。TGF-βⅠ型受体的R-Smad磷酸化发生于SXS基序C端的两个丝氨酸残基。Smad 3和Smad 4能够直接与保守的5’-CAGA-3’DNA结合基序相结合，但Smad2却不含这个SXS基序。R-Smad与Smad 4形成异构体复合物是由MH2结构域介导的，该复合物的形成暴露了核输入信号，同时屏蔽了核输出信号，导致其在细胞核内积聚。在细胞核中，该复合物作为转录因子能够与其他DNA结合转录因子、辅激活因子、抑制因子以及染色质重塑因子相互协同作用，激活或抑制下游靶基因的转录活性[10]。I-Smad7具有与R-Smads和Smad4 MH2结构域同源的羧基末端区域，可拮抗TGF-β受体/Smad信号活性。在基础条件下，Smad7存在于细胞核，但在TGF-β诱导的受体复合物形成时，Smad7可易位至细胞膜[11]。Smad7能够与激活的TGF-β受体复合物结合，从而阻断R-Smads和激活的受体之间的相互作用，抑制下游信号的传导。此外，Smad7还可在细胞核中与E3-泛素连接酶Smurf1或Smurf2相互作用，在TGF-β激活时，Smad7-Smurf复合物易位到细胞膜，诱导TGF-β受体泛素化及其蛋白酶体降解途经激活[12]。Smad7还可直接与DNA结合，竞争性拮抗Smad-DNA复合物形成，从而抑制TGF-β介导的转录活性[13]。

3 Smad非依赖性的信号通路

TGF-β信号传导并不完全依赖Smads，因而进一步增加了TGF-β信号传导的复杂性。TGF-β能够诱导多种组织中上皮和内皮细胞Erk信号通路的激活，促进粘着连接的溶解和细胞迁移，该过程一方面通过间接活化TGFα及纤维母细胞生长因子自分泌循环[14]，另一方面是直接通过Src调节或通过TGF-β RⅡ自身磷酸化酪氨酸残基[15]。此外，TGF-β RⅡ自身磷酸化酪氨酸残基能够激活SHCA，从而促进SHCA/Grb2/SOS复合物的形成。然后，该复合物通过C-RAF、MEK和ERK激活下游信号通路，激活细胞膜上的肾素—血管紧张素系统。TGF-β还可以依据细胞环境分别通过MKK4和MKK3/6促进JNK和p38-MAPK的激活，调节细胞凋亡或细胞迁移[16-17]。在上游，不是通过TRAF6介导的TAK1的富集，就是通过MAPKK KS、MEK1和MLK3磷酸化MKKs[18-19]。此外，PI3K/Akt信号通路亦介导一些TGF-β生物学功能。从机制上来看，PI3K的p85调节亚基似乎在结构上捆绑于TGF-βRⅡ，接近于复合物上富集TGF-β RⅠ激活PI3K和启动下游信号的TGF-β刺激。TGF-β能够以非依赖性的Smad2/3方式迅速激活RhoA和Cdc42/Rac1途径，诱导肌动蛋白聚合参与EMT过程[20]。经典(Smad依赖性的)和非经典(非Smad依赖性的)TGF-β信号通路之间的交互作用有助于肿瘤的发展[21]。

在癌变和肿瘤进展中，TGF-β具有基础性作用。然而，多数研究确定TGF-β在这一过程中具有双重作用。肿瘤发生之前，TGF-β能够抑制正常及癌前病变的上皮细胞生长。然而，由于肿瘤细胞中基因表达的增加和表观遗传改变，伴随局部分泌的TGF-β水平的递增，促进了侵袭和转移的发生。因为TGF-β的功能取决于组织类型和遗传背景，这进一步增加了其功能的复杂性[22]。

4 TGF-β与食管癌

食管癌是中国第五大恶性肿瘤，已成为中国癌症死亡的第四大病因[23]。食管癌的危险因素包括吸烟、不良饮食习惯和维生素缺乏等[24]。通常，TGF-β家族配体与TGF-β受体胞外域结合后，触发了经典Smad蛋白信号下游效应分子激活，导致了与组织稳态、肿瘤生长和进展相关的重要基因的转录[25]。有趣的是，TGF-β信号在调节肿瘤发生中似乎具有双重作用：在早期阶段它是一种生长抑制因子，但在晚期阶段，TGF-β促进了肿瘤恶化和转移[26]。这种双重作用在ESCC和EAC中已证实。食管癌发生早期阶段，TGF-β信号通路似乎对肿瘤的生长有抑制作用，EAC和ESCC细胞系均通过下调Smad4或c-Myc表达，而降低TGF-β反应性[27]。与此一致的是，Smad4在EAC的化生—增生—腺癌病变过程中表达逐渐减少，Smad4表达恢复后，对增殖的抑制能力恢复[28]。有趣的是，ESCC中TGF-β研究结果并不一致。DACH1甲基化导致TGF-β下调或Smad4表达降低，与浸润深度增加、肿瘤分期晚和分化差有关[29-30]。 蛋白酶体降解引起的TGF-β下调实际上抑制了体内肿瘤的生长和侵袭[31]。尽管如此，针对ESCC患者的研究结果仍支持TGF-β的肿瘤抑制作用，信号传导减少与更具侵袭性的肿瘤特征和更差的预后相关[32]。

在肿瘤发生晚期，TGF-β似乎具有促肿瘤作用。据认为，这种“转换”主要是由中介蛋白质分子的丢失所介导的，而中介蛋白的丢失是适当控制TGF-β肿瘤抑制功能所必需的。例如，β2-spectrin(β2SP)是一种衔接蛋白，在细胞—细胞相互作用和维持上皮细胞极性中起着至关重要的作用。在EAC中，肿瘤细胞中β2SP的缺失导致SOX9和c-Myc的表达增加，而其他TGF-β靶标，如E-cadherin和细胞周期调节剂p21和p27的表达降低[33]。TGF-β还能激活成纤维细胞，这也有助于肿瘤浸润、血管生成和EMT[34]。与健康对照组相比，食管癌患者的血清及肿瘤组织中TGF-β表达增高与肿瘤分期及预后有关[35]，并且TGF-β水平较高者，放疗后血清TGF-β水平降低[36]。癌症相关的成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)在癌症发生发展的多阶段过程中发挥着非常重要的作用，CAF表达成纤维细胞活化蛋白-α和α-平滑肌肌动蛋白，是由癌细胞分泌的TGF-β等因子诱导[37]。最近的研究也表明，miRNAs参与成纤维细胞向CAFs的转化[38]，这一发现在ESCC中得到了证实[39]。在这种状态下，CAFs可以通过分泌活性因子与肿瘤或其他间质细胞通讯，激活促炎途径，破坏免疫监视，改变细胞外基质，从而调节EMT[40]。血管内皮生长因子在ESCC中的表达与肿瘤大小有关[41]。另外，TGF-β的过表达和TβR的低表达与ESCC的浸润深度和病理分期有关[42]。Smad4在ESCC中的表达与浸润呈负相关[43]。Smad2的降解也可能导致ESCC肿瘤的发生和预后不良[44]。最后，TGF-β/Smad信号还能够通过PTEN/PI3K促进ESCC的EMT发生[45-46]。总之，这些变异使TGF-β通过EMT促进肿瘤进展和最终转移。实际上，在EAC和ESCC中，TGF-β信号通路激活增加晚期肿瘤分期，并与转移、治疗耐药有关[47-48]。

microRNAs是多种癌症诊断和预后的生物标志物之一，并可调节食管癌中的TGF-β信号[49]。miR-17/20a通过靶向TβR2和Smad锚定受体激活降解来抑制TCC-β/整合素β6亚基途径，介导ESCC细胞迁移和侵袭[50]。此外，TGF-β在miR-455-3p介导的ESCC进展中起作用[51]。miR-655通过靶向TGF-β信号传导所需的ZEB1和TβRⅡ来抑制ESCC进程并抑制EMT发生[52]。最近发现，miR-32通过CXXC5介导的TGF-β信号传导抑制作用促进ESCC转移过程[53]。

食管癌组织中异常表达的细胞骨架相关蛋白与TGF-β信号通路之间的相互作用可以促进ESCC的进展。在神经元迁移中起关键作用的Reelin负调节TGF-β诱导的ESCC细胞迁移。TGF-β通路通过转录因子Snail抑制Reelin的表达[54]。Fascin是一种肌动蛋白相关蛋白，可诱导细胞膜突起，通过TGF-β通路调节结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)和富半胱氨酸肝素结合蛋白61(cysteine-rich protein 61,CYR61)的水平，来促进ESCC细胞的增殖和侵袭[55]。CYR61和CTGF的过表达与ESCC生存不良有关[56]。Ezrin是一种细胞骨架交联蛋白，也通过TGF-β和MAPK信号通路促进ESCC细胞增殖和侵袭[57]。上述研究结果表明，TGF-β信号可以在癌变前期抑制肿瘤的发生，在癌变的后期促进食管癌的发展和转移。

5 展望

TGF-β通路在癌症进展过程中发挥着重要作用，而且是公认的抗转移治疗的靶点。目前的临床试验集中于TGF-β活化阻断剂、配体抑制物、针对TGF-β受体相互作用的中和抗体、反义寡核苷酸、TGF-β受体激酶活性的抑制剂等。然而，由于TGF-β肿瘤抑制作用取决于细胞微环境的变化，影响细胞因子复合物的功能，TGF-β信号作为一种治疗策略必须慎重处理。