PD-1/PD-L1在消化系统肿瘤中的研究进展

郭晓宇，米建强，米优嘉，左汪洋

程序性死亡受体-1(programmed death receptor-1，PD-1)及程序性死亡配体-1(programmed death ligand-1，PD-L1)的免疫抑制剂已应用于恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌等诸多肿瘤的治疗，且已取得了相应的效果。检测消化系统肿瘤组织中PD-1/PD-L1的表达情况，可帮助消化系统肿瘤的诊断及指导免疫抑制剂在消化系统肿瘤治疗中的应用。本文通过对PD-1/PD-L1的机制、应用情况及应用前景、有关PD-1/PD-L1的检测及判读做一综述，为后续的研究提供参考。

1 PD-1/PD-L1的结构、功能和作用

程序性死亡受体-1称为PD-1(即CD279)，是CD28家族中的一员，细胞的穿膜受体之一，由288个氨基酸排列而成的蛋白分子组成，主要表达于活化的B细胞、T细胞表面[1-2]。PD-1有两个配体，分别是程序性死亡配体-1(PD-L1)和程序性死亡配体-2(PD-L2)，两者基因均位于染色体9p24.1，有37%同源序列，可编码产生Ⅰ型跨膜蛋白。 PD-L1又被称为B7-H1，是B7家族中的一员，可在多种肿瘤细胞表面表达，PD-L2主要在抗原提呈细胞表面表达[2]。在肿瘤的发生中，T细胞介导的免疫反应需要双信号参与，第一信号是由抗原、T细胞受体三元复合体、主要组织相容性复合体组成的抗原识别信号(pMHC-TCR) 组成，第二信号是B7与CD28所形成的共刺激信号[2-3]，第一信号和第二信号均能激活T细胞，起到免疫防御的作用。PD-1/PD-L1的结合，可使T细胞胞质内发生磷酸化，结合蛋白酪氨酸磷酸酶，形成SHP-2，可抑制第一信号产生的ZAP-70、PI3K等分子，从而抑制T细胞的活化[2-3]。另外，PD-1可以通过增加转录因子BATF的表达，进一步对抗由TCR和CD28共同刺激产生的下游信号，抑制T细胞的功能[3]。除PD-1、PD-L1为免疫治疗的靶点外，其他的免疫靶点也逐渐引起人们注意，如LAG3、TIM3、CTLA-4等。研究显示胃癌的发病与TIM3基因的改变有关，并且发现在胃癌患者T细胞上的表达明显高于正常组织，靶向阻断TIM3通路有望成为免疫靶向治疗胃癌的新方法[4]。

2 PD-1/PD-L1在消化系统恶性肿瘤中的研究

2.1 PD-1/PD-L1在胃癌中的表达及与预后的关系胃癌是最常见的消化道肿瘤之一，发病率和死亡率在恶性肿瘤中排名第二、第三[5]。在我国，胃癌每年确诊量有41万例，治疗后其5 a生存率仍低于40%[6]，严重威胁着人类的生命健康。而胃癌的诊断及治疗方法目前仍以组织病检及手术和放化疗为主，虽然对早期胃癌的防治取得了较好的成绩，但早期胃癌发病隐匿，发现时大多已是进展期胃癌[5]。近年来研究显示PD-L1在胃癌组织中表达率为46.6%～70.1%[7]，并与肿瘤分期、分化程度、淋巴结转移、脉管浸润等相关，提示PD-L1可能是胃癌预后的相关指标[8]。丁思思等[9]采集并对比18例健康者的外周血和44例胃腺癌患者分别在术前术后的外周血，用流式细胞术检测CD3+CD4+T、CD3+CD8+T细胞表面PD-1/PD-L1的表达和CD14+单核细胞表面PD-L1的表达情况，结果表明：与健康组相比，胃癌患者外周血CD14+单核细胞表面PD-L1表达水平显著增加；与术前相比，术后外周血CD4+T和CD8+T细胞PD-L1表达显著增加。说明PD-L1在CD14+单核细胞的表达可以预测肿瘤的发生情况，术后外周血T细胞PD-L1的表达升高，可能与手术创伤所产生的应激反应有关。而PD-1无论是术前或术后在T细胞表面均无变化，进一步说明在应激作用下PD-L1在T细胞上的表达与PD-1的表达无相关性[9]。提示外周血中CD4+T、CD8+T细胞和CD14+单核细胞表面PD-L1表达对胃癌患者的治疗及预后具有预测价值。

2.2 PD-1/PD-L1在食管癌中的表达及与预后的关系食管癌的发病仅次于肺癌、胃癌和肝癌，是最常见的消化道肿瘤之一。据统计，有70%的食管癌发生在中国，该疾病严重影响国民健康。一项收纳了1 119例食管癌的Meta分析显示：PD-L1高表达者的死亡风险高(HR=1.90，95%CI：1.28～2.81，P=0.001)，且PD-L1的表达与发生远处转移有明显相关性，提示其可能为食管癌预后的标记物[10]。陈俊升等[11]收集67例食管癌术后的标本，检测PD-1/PD-L1的表达，分别以5%和10%为阳性标准，PD-1的阳性表达率为67.2%和61.2%，PD-L1的阳性表达率为31.3%和25.4%，研究临床病理特征与预后的关系，得出结论：PD-1/PD-L1在食管癌组织中存在高表达，且PD-L1表达阳性高低可能与肿瘤浸润深度有关。肿瘤的位置、病理分级、临床分期及淋巴结转移情况等，对食管癌中PD-L1的表达均有影响。然而，另有文献指出：PD-L1阳性患者的疾病复发风险会降低，并且指出PD-L1会是食管癌预后的有利指标，而PD-1的表达与临床病理因素及食管癌的预后无显著相关性[12]。2015年美国Chicago的ASCO会议中，Keynote-012的Ⅰ期研究发现，随着PD-L1表达水平的提高，患者ORR、PFS有降低的趋势。对于这两种相悖的实验结果，Jiang等[12-13]的研究解释为：早期食管鳞癌患者的PD-L1高表达，并作为食管癌患者的有利预后因素，是因为早期食管鳞癌患者体内PD-L1可通过与机体内非PD-1的免疫受体结合，从而增强了抗肿瘤的免疫反应，使T细胞增殖，免疫分子(如白介素-10和干扰素-γ)分泌增强；而食管癌晚期PD-L1则主要与PD-1结合，诱导T细胞凋亡，造成免疫抑制，最终导致较差的预后。

2.3 PD-1/PD-L1在结直肠癌中的表达及与预后的关系结直肠癌发生远处转移的患者，5 a生存率低于12%，研究显示PD-L1在结直肠癌中的表达为45.0%[14]。汤国军等[14]选取100例结直肠癌标本、100例癌旁组织标本、100例结直肠腺瘤标本、100例正常标本，应用免疫组织化学方法进行实验，发现PD-L1在结直肠癌、结直肠腺瘤、癌旁、正常结直肠中的阳性表达率依次递减，最终得出结论：结直肠癌组织中PD-L1表达水平与结直肠癌细胞的恶性程度呈正相关，PD-L1在结直肠癌中的高表达预示着不良的预后。另有雷星等[15]研究PD-L1在结直肠癌、癌旁、正常组织中的表达，及PD-L1的表达与结直肠癌患者年龄、TNM分期、肿瘤大小、组织学分级、淋巴结转移等临床病理关系得出：PD-L1在结肠癌组织中的表达明显升高，并与淋巴结转移及预后密切相关。

2.4 PD-1/PD-L1在胰腺癌中的表达及与预后的关系胰腺解剖位置较深，发病隐匿，胰腺癌是恶性程度最高的消化系统肿瘤[16]。李俊昊等[17]收集复旦大学附属中山医院的68例胰腺癌患者的蜡块标本，进行PD-L1的免疫组织化学染色，阳性率为80.9%，并利用Kaplan-Meier法、Log-Rank检验及Cox比例风险模型分析了PD-L1的表达与生存时间的关系得出：PD-L1与可切除胰腺癌的预后密切相关，PD-L1表达量高预示着胰腺癌不良的预后。免疫试剂的推广，在胰腺癌的应用中显示：PD-L1在胰腺癌中虽有表达，但总体低于非小细胞肺癌、恶性黑色素瘤，单药应用治疗胰腺癌，没有取得理想的疗效[18]，这可能与胰腺肿瘤微环境的高度抑制性有关[19]。所以，免疫抑制剂在胰腺癌中的应用，仍需在细胞及分子水平上的进一步的临床试验和研究。

2.5 PD-1/PD-L1在胆囊癌中的表达及与预后的关系胆囊癌在消化系统中的发病率排第六，由于解剖学位置距体表较深，症状隐匿，这为胆囊癌的诊断和治疗带来了困难。童玲等[20]搜集41例胆囊癌患者大体标本，应用免疫组织化学的方法进行实验，统计PD-L1在胆囊标本上的表达情况，用χ2检验比较胆囊癌和癌旁组织中的表达，得出结论：PD-L1在胆囊癌旁及胆囊癌中的表达率分别为0%和34.14%，同时χ2检验的结果显示：胆囊癌和癌旁组织PD-L1的表达差异有统计学意义。

2.6 PD-1/PD-L1在肝癌中的表达及与预后的关系肝脏病变隐匿，与酗酒、抽烟、不良饮食习惯等多种因素有关，确诊时往往已错失最佳治疗时机。程小珍等[21]研究肝癌患者肝动脉化疗栓塞术(trancatheter arterial chemoembolization,TACE)前后外周血中PD-1、PD-L1的表达，发现在肝癌患者外周血CD4+T、CD8+T细胞及APC细胞表面PD-1与PD-L1的表达要高于正常组，术前术后PD-1和PD-L1在外周血中的表达均有差异，得出肝癌患者外周血PD-1、PD-L1表达升高。周晓思等[22]收集原发性肝癌标本81例，利用免疫组织化学法进行染色，其中29例癌旁组织作为正常对照，结果，肝癌实验组中AFP和PD-L1阳性表达率明显高于对照组，提示术前AFP浓度可作为PD-L1抗体治疗的重要指标[22]。综上，PD-1、PD-L1在肝癌组织中的表达有望成为指导肝癌治疗及评判预后的标准之一。

3 PD-1/PD-L1检测标准的筛选

细胞阳性显色指的是细胞膜或细胞质中出现黄至棕褐色颗粒。实验结果的评定往往是结合细胞染色强度和阳性细胞数百分比共同评定。染色强度：无着色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。先低倍显微镜下观察整张切片，分别在肿瘤细胞及肿瘤间质细胞随机选取5个高倍视野(×400)，每个视野计数100个细胞，阳性细胞率(%)=阳性细胞数/观察细胞数×100%。阳性细胞分级为：阳性细胞率≤10%为1分，11%～50%为2分，>50%为3分。染色强度评分和阳性细胞分级评分的乘积>3分为阳性表达。细胞质或细胞膜上任一项阳性均为阳性表达；癌细胞或癌间质淋巴细胞上任一项阳性，该标本也为阳性表达[8]。为保留抗原的活性，应用PD-L1做免疫组织化学染色的标本需在3 a以内。不同克隆号抗体评判标准略有不同，PD-L1在非小细胞肺癌中，选用TPS(Tumor Proportion Score)判读标准。如：克隆号为22C3、28-8、SP263单克隆抗体染色的阳性定义为：任何强度完整或部分肿瘤细胞膜染色。评分不考虑肿瘤细胞质染色，淋巴细胞、巨噬细胞等的染色也不考虑在内。而SP142抗体克隆PD-L1染色阳性定义：PD-L1阳性免疫细胞和肿瘤细胞均被考虑纳入PD-L1染色阳性标准[23-24]。除非小细胞肺癌的其他肿瘤，选用的是CPS(Combined Positive Score)判读标准，即：任何强度的染色细胞[肿瘤细胞、癌巢内淋巴细胞和巨噬细胞和或邻近的间质细胞(胞膜和或胞质染色)]与肿瘤细胞总数的比值，乘以100[25]。

4 PD-1/PD-L1免疫抑制剂在肿瘤治疗中的应用

应用免疫抑制剂治疗肿瘤，可以是阻断PD-1分子应答途径，也可以是阻断PD-L1分子应答途径，或同时阻断PD-1/PD-L1分子应答途径，因此有PD-1免疫抑制剂和PD-L1免疫抑制剂[26]。PD-1/PD-L1免疫抑制剂对不同肿瘤的治疗尚处于不断的临床试验中，一项包含了1 388名胃食管肿瘤患者的荟萃分析显示：应用PD-1及PD-L1免疫抑制剂治疗后，患者客观反应率(ORR)=10%，疾病控制率(DCR)=32%，总生存期OS(6个月)=52%，无进展生存期PFS(6个月)=18%，OS(12个月)=40%，PFS(12个月)=8%，3级以上不良事件发生率为12%(95%可信区间:10%～15%)。数据分析表明，PD-1/PD-L1免疫治疗对晚期胃癌患者具有有效的抗肿瘤活性和可控的不良反应[27]。

4.1 PD-1免疫抑制剂在消化系统肿瘤中的研究

派姆单抗(Pembrolizumab)是特异性抗PD-1的人源化IgG4单克隆抗体，在KEYNOTE系列实验中显示出良好疗效，美国食品药品监督管理局(FDA)批准了其在晚期或不可切除的Ipilimumab耐药的黑色素瘤，以及以铂类为基础化疗耐药且PD-L1特定检测方法阳性的晚期非小细胞肺癌中使用，它是FDA唯一一个批准在胃癌治疗中作为三线治疗的免疫抑制剂[28]。在KEYNOTE-012临床试验中，39例PD-L1阳性表达的晚期胃癌患者持续应用Pembrolizumab 24个月，结果22%的患者确认获得了影像学部分缓解，中位起效时间为8周，中位疗效持续时间为24周，随后的研究也证实 PD-L1的表达水平与客观缓解率(ORR)相关[29-30]。另外有关Pembrolizumab在复发、转移胃食管癌患者中疗效的三期临床试验正在进行中，KEYNOTE-062和KEYNOTE-061分别将单药、单纯化疗、联合顺铂或 5-氟尿嘧啶(5-Fu)的对比，总生存期(OS)与完全缓解率(CPS)没有显示优于单纯化疗组，但是单药比化疗安全性高。另外，Pembrolizumab在肝癌中的治疗研究显示：在KEYNOTE-224的开放性二期临床试验中，对索菲拉尼治疗无法耐受的104例患者，应用Pembrolizumab，患者的ORR为16.3%，中位PFS为4.8个月，并未达到预期的疗效，但是KEYNOTE-240及KEYNOTE-394对Pembrolizumab单药应用于肝癌的治疗仍在研究中[31]。

纳武单抗(Nivolumab)也是抗PD-1的人源化IgG4单克隆抗体之一，FDA批准了与Pembrolizumab同样的适应证。一项收纳493例胃癌及胃食管癌患者的临床试验，将使用和未使用曲妥珠单抗的患者分为两组，其中330例患者使用Nivolumab(59例用过曲妥珠单抗，271例没有用过曲妥珠单抗)，163例患者使用安慰剂(22例用过曲妥珠单抗，141例没有用过曲妥珠单抗)，结果显示，使用Nivolumab的患者总的生存期和无疾病进展期均比对照组长，说明不管曲妥珠单抗以前在晚期胃癌及食管癌患者中的使用情况如何，Nivolumab作为三线或二线治疗方案是有效和安全的[30,32]。

4.2 PD-L1免疫抑制剂在消化系统肿瘤中的研究

Avelumab是一种人抗PD-L1的IgG1单克隆抗体，在晚期转移性胃和胃食管结合部癌的早期研究中显示出抗肿瘤活性，可用作一线维持治疗[33]。有关Avelumab的一项开放的三期临床试验，收集499名局部晚期/转移性且HER2阴性的胃和胃食管结合部腺癌患者，在接受一线奥沙利铂、氟嘧啶化疗12周病情稳定后，以1∶1的比例随机接受Avelumab维持治疗或继续化疗，结果PD-L1阳性人群的总体存活率均有提高，说明Avelumab治疗胃癌的安全性和有效性[27]。另外正在研究中的PD-L1抑制剂还有阿特朱单抗(Atezolizumab)、度伐单抗(Durvalumab)等，其安全性及有效性仍在进一步验证。

4.3 靶向药物等的联合用药

癌症的发生是癌症细胞、细胞外基质与免疫细胞等肿瘤微环境共同作用的结果。有研究显示抗PD-1、PD-L1抗体在胃癌治疗方面尚有一定局限性，需要从多方面着手。有研究报道曲妥珠单抗和免疫治疗结合方案可能成为胃食管癌患者新的治疗方案。Stagg等[34]发现PD-1、HER2抗体联合治疗可提高HER2靶向治疗在模型小鼠中的疗效，并提出了假设：免疫治疗可以增强免疫介导的抗HER2治疗效果。而且据统计，50%PD-L1阳性的胃癌患者都过度表达HER2，因此曲妥珠单抗和免疫治疗结合有望提高胃癌患者的治疗效果，成为新的治疗方案。

Ramucirumab与Nembrolizumab联合用于治疗胃-食管交界处肿瘤，非小细胞肺癌及尿路上皮癌，一项1a/b阶段的临床试验显示：收入的92例患者，其中41例胃-食管交界处肿瘤，27例非小细胞肺癌，24例尿路上皮癌，总体客观缓解率达15.2%，参与试验的患者，发生的不良反应有高血压、腹痛等，总体上，Ramucirumab与Pembrolizumab联合应用于肿瘤的治疗，安全易于管理，这种组合可以在有或没有化疗的情况下进一步探索，特别是对于单剂检查点抑制剂没有显示出比化疗有额外益处的肿瘤患者[35]。

有关PD-1/PD-L1的免疫抑制剂在多种肿瘤治疗中都取得了成绩，在非小细胞肺癌和恶性黑色素瘤中的治疗部分已经被列入NCCN国际治疗指南，在消化系统肿瘤治疗中的应用也在进一步临床试验中。目前主要存在的问题：①符合免疫治疗的消化道肿瘤患者的筛选标准如何评定；②PD-L1高表达的患者接受免疫治疗是否会有更好的疗效及预后；③PD-1/PD-L1适合应用免疫抑制剂的临床检测量；④怎样提高符合免疫治疗患者的检出率，外周血的测量是否可行，免疫组织化学法和基因的检测，哪一个更为经济有效；⑤免疫抑制剂在消化道肿瘤中的研究仍缺少大数据临床试验支持，适应症和并发症尚不十分清楚，对于免疫治疗出现并发症的处理，尚缺少临床试验及统计学数据支持。免疫治疗虽存在诸多问题，但为消化道肿瘤治疗提供了新思路。