英孚立昔肠黏膜丢失与克罗恩病初治失反应关联研究

肖军华 贺志龙 陈冰心 高苏俊 张永凯 许春芳

1苏州大学附属第一医院消化内科（江苏苏州215006）；2扬州苏北人民医院（江苏扬州225001）；3上海中医药大学附属普陀医院（上海200062）

克罗恩病（Crohn′s disease，CD）由于其致病机理未明，目前仍没有根治方法，近年来CD在亚洲国家发病率呈上升趋势［1］。CD常用药物治疗反应差，且难以达到黏膜缓解，并发症多，易产生瘘管、狭窄，手术率高，术后易复发，伴随失去工作能力的高风险。抗TNF-α单克隆抗体的应用改善了IBD的诊治以及预后［2］。英孚利昔单抗（Infliximab，IFX）是一类嵌合的抗TNF抗体，是CD目前最为有效的治疗措施，抗肿瘤坏死因子的使用，降低了CD的手术率以及并发症的发生率。然而，还有一定数量的患者TNF抗体治疗仍无效（有约1/3的CD患者对于IFX初治无效），而另外一些患者经过一段时间治疗后演变为继发性无效［3］。这两种现象的原因及其机制依然不明。

IFX初治无效临床定义是经IFX诱导治疗不能改善临床症状和体征［4］。在最初的英夫利昔单抗治疗难治性CD的“Targan”研究中，IFX初治有效被定义为4周后克罗恩病活动指数CDAI（Crohn′s disease activity index，CDAI）降 低70［5］。目前大多数临床研究将连续两次至少5 mg/kg英夫利昔单抗输注后，在4周评估缺乏反应定义为初治无效［6-8］。治疗无效常与血清药物低浓度和或体内产生药物中和抗体相关［9-11］。然而，IFX初治无效的原因在很大程度上依然是未知的，虽然目前已经提出了一些可能的机制：包括药代动力学或药效学方面或者两者都有［12-13］。前者可能是由于疾病的高炎症状态与过量的TNF-α负荷，和/或抗肿瘤坏死因子抗体的产生。后者可能是由于非TNF-α介导的免疫炎症性反应的机制主导。初治无效的另一种机制是抗体清除增强导致药物浓度不足。单克隆抗体的清除受多种因素的影响，包括体重指数、性别、同时使用免疫抑制剂、血清白蛋白浓度和炎症负荷［14-16］。近期研究表明，粪便中抗体的丢失可能代表着一个可能的机制：从“渗漏的肠道”中增加药物清除，导致对重症UC病人的治疗效果不佳［17］。为了证实CD患者IFX初治无效是否有IFX肠道渗漏相关，本研究进行了以下实验。

1 对象与方法

1.1 研究对象回顾分析了2016年9月至2019年9月期间苏州大学附属第一医院消化科住院的回结肠型CD患者。入选患者符合我国CD诊断指南标准［18］，包括临床、内镜、以及组织学表现。并经激素及免疫抑制剂失效；既往未使用IFX治疗；病变部位位于回结肠的CD患者。排除标准：年龄在16岁以下、70岁以上；肝、肾功能不全，心功能不全；妊娠期；碘过敏患者；既往使用过抗肿瘤坏死因子α治疗的患者。入选后，所有患者应用5 mg/kg IFX静脉注射治疗。同时收集入选患者5个时间点的粪便，分别为第1、4、7、10、14天。收集入选患者临床基线参数：包括CDAI、内镜下评分SES-CD（3为缓解，4 ～10轻度，11 ～19中度，20为重度），以及临床实验室指标（HB，白蛋白，CRP、ESR）。应用CDAI评估临床活动：其中CDAI 150，认为CD患者疾病处于缓解期、CDAI＞150，应为CD患者疾病处于活动期，并结合临床资料进行生化检测（包括ESR，CRP，全血细胞计数，和纤维蛋白原）以及血清IFX浓度（第2周），以及肠镜（入选时及第8周）。所有入选患者均告知其相关信息及权益，并签署知情同意书。

1.2 研究方法粪便处理：收集的粪便样本用含6%胎牛血清的磷酸盐缓冲液1∶5稀释后，涡旋60 min，3 000 g离心5 min，取上清存储在-20 ℃冰箱。利用ELISA试剂盒（Sanquin Biologicals Laboratory，Amsterdam，The Netherlands）测定IFX第二周血清浓度以及粪便浓度浓度。在第2月及3月评估患者临床及内镜反应。

1.3 判定标准临床有效定义为：CDAI下降＞70。内镜有效定义为：SES-CD 3。入选患者32例（男18例，年龄中位数48岁，范围16 ～61岁，病程中位数39个月，范围7 ～29个月）。

1.4 统计学方法应用SPSS 20.0进行数据分析。所有连续变量均用表示。两组间的IFX血清及粪便浓度组间差异应用t检验进行分析，当非正态分布时，采用t′检验，IFX血清浓度与粪便浓度关联采用线性相关分析检验。P ＜0.05为差异有统计学意义。

图1 粪便中英孚立昔单抗浓度Tab.1 Infliximab concentrations in fecal supernatant 14 days after the first infliximab infusion

表1 IFX 治疗有效率Tab.1 Effects of Infliximab Induction

2 结果

2.1 入选CD 患者粪便IFX 检测结果32位中重度回结肠型既往未接受IFX治疗的CD患者入选。所有入选患者在第0、2、6周接受5 mg/kg IFX治疗。在IFX治疗后的前2周，32名患者中有27人（84.3%）的粪便中检测到IFX，所有粪便样本中有135人次（75.4%）的粪便中检测到IFX。在首次注射IFX后的第1天测定的浓度最高［粪便浓度第1天：（7.14±0.87）mg/mL］，见图1。其中第1天，在32例患者中的27例粪便样本中检测到IFX。粪便IFX浓度随着时间持续下降。

表2 第2 周临床反应率Tab.2 Week 2 clinical response ±s

表2 第2 周临床反应率Tab.2 Week 2 clinical response ±s

注：IFX，infliximab；CR，clinical response 临床有效；NR，nonresponse 无效；ER，endoscopic response 内镜有效

DAY 1 3 7 14 CR（IFX）1.04±0.58 0.31±0.11 0.34±0.09 0.21±0.07 NR（IFX）7.01±0.71 1.22±0.08 0.45±0.13 0.42±0.11 t/t′值2.80 2.31 1.51 0.95 P 值0.031 0.074 0.12 0.31

表3 第8 周内镜反应率Tab.3 Week 8 endosopic response ±s

表3 第8 周内镜反应率Tab.3 Week 8 endosopic response ±s

注：IFX，infliximab；CR，clinical response 临床有效；NR，nonresponse 无效；ER，endoscopic response 内镜有效

DAY 1 3 7 14 ER（IFX）0.84±0.31 0.32±0.11 0.13±0.06 0.11±0.04 NR（IFX）4.14±0.61 1.31±0.34 0.41±0.22 0.30±0.11 t/t′值2.01 1.89 0.89 0.72 P 值0.062 0.074 0.21 0.42

表4 第3月临床反应率Tab.4 Month 3 clinic response ±s

表4 第3月临床反应率Tab.4 Month 3 clinic response ±s

注：IFX，infliximab；CR，clinical response 临床有效；NR，nonresponse 无效；ER，endoscopic response 内镜有效

DAY 1 3 7 14 CR（IFX）0.74±0.31 0.34±0.14 0.21±0.14 0.18±0.31 NR（IFX）2.81±0.66 0.64±0.34 0.31±0.17 0.14±0.31 t/t′值1.62 1.32 0.95 0.64 P 值0.10 0.21 0.32 0.57

表5 早期预测内镜改善指标Tab.5 Early predictors for endoscopic response

第2周，血清中IFX浓度为（22.15±7.17）mg/mL。临床有应答者：第2周观察32例患者中的21例（67.7%），第3月观察32例患者中的17例（53.1%）（表1）。

2.2 CD 患者粪便IFX 与临床及内镜应答32例患者中28例在第8周进行了第二次内窥镜检查，其中有12例（42.9%）有内镜改善（SES-CD 3）。第2周时，无应答者在注射IFX后第1天粪中IFX浓度显著高于第2周有应答者［（7.01±0.71）mg/mL vs.（1.04±0.51）mg/mL，P=0.031］，见表2。8周后内镜无改善者，其粪便IFX相比内窥镜评分改善的浓度较高［（4.14±0.61）mg/mL vs.（0.84±0.31）mg/mL，P=0.062］，见表3，但差异无统计学意义。

3月临床无应答者，粪便IFX浓度更高［（2.81±0.56）mg/mL vs.（0.74±0.24）mg/mL，P=0.10］，如表4，但差异无统计学意义。

2.3 CD患者粪便IFX与血清IFX和临床参数的相关性分析进一步分析了包括C-反应蛋白（CRP）、血红蛋白、血清白蛋白以及CDAI在内的多种生化及参数，其中粪IFX在第1天的浓度是内镜对IFX反应的唯一预测因子（表5）。临床无应答者第2周血清IFX中位浓度为（21.55 ± 5.12）mg/mL，而应答者为（23.15 ± 6.32）mg/mL。没有直接观察第一天IFX粪便水平和第二周IFX血清水平之间的相关性（r=-0.1 988，P=0.60，图2）。

图2 粪便IFX 浓度与血清IFX 浓度相关性Fig.2 Correlation feces IFX and serum IFX concentration

3 讨论

本研究证实肠内抗TNF-α抗体丢失与有关中度至重度活动期CD患者IFX初治无效有关。本实验表明粪便IFX浓度峰值为第一次注射大约1 d后，IFX最大的损失发生在血清药物浓度最高时，且黏膜炎症最重，因此，造成漏出的单抗最多。粪便中IFX明显丢失的患者基线病情更为严重。患者基线血清白蛋白浓度、CRP、HB以及CDAI在预测IFX初治反应，无明显价值。因为主要由回结肠疾病CD患者，疾病程度及粪便流失情况两者之间无显著相关性。

本研究只包括了CD患者，未纳入溃疡性结肠炎患者。然而，国外的一项研究中，入选和分析了IFX治疗UC患者的粪便样本。其中大部分患者的粪便也测量出IFX，这表明这种途径的抗体丢失可能并不局限于CD［17］。在本研究中，观察到初治无效较以前报道的高［19］，这很可能是由于这个特殊的队列主要由中重度活动性克罗恩病（CDAI ＞220分）患者组成。虽然IFX的粪便丢失似乎是CD的初治无效的原因，但它可能不是影响IFX的药代动力学唯一的因素［9-10］。早期粪便IFX浓度和第14天血清IFX浓度之间缺乏相关性，可由其他影响药物血清浓度的因素来解释。尽管有人认为IFX血清药物浓度与临床效果高度相关，最近的数据表明，黏膜浓度可能更重要的是，至少在严重的结肠炎中，结肠黏膜IFX浓度与临床疗效相关［20］。研究表明，黏膜抗TNF-α浓度与组织抗IFX单抗的比值，结肠炎症严重部位其水平低于正常对照组，这表明黏膜炎症是抗体丢失的可能原因［21］。结肠黏膜以及粪便IFX浓度可能可以预测CD初治患者有效性。

而本研究发现，血清英孚利息浓度与粪便IFX浓度无相关性，IFX的粪便丢失可能只是IFX清除途径之一，还受其他因素影响。研究表明，IFX粪便内浓度其与网状内皮系统内蛋白水解的相关。最近，利用荧光抗体的分子成像在肠道黏膜显示结合TNF-α阳性的免疫细胞被认为是预测生物治疗反应的一种潜在模式［22］。粪便中单克隆抗体的丢失也可能只是代表疾病活动程度，而与初治反应无因果关系。它还可以认为是疾病活动的生物标志物，可识别结肠切除术的高风险患者［23］。最近有研究表明肠道纤维化也可以降低IFX治疗CD疗效［24］，可能与降低病变肠黏膜IFX浓度有关。

本研究表明，抗TNF-α单抗可以在CD粪便中可被检测到。但本研究可能保守估计了经肠道抗体丢失的数量，因为渗漏出的抗体蛋白可能已经被大量肠腔的蛋白酶降解部分。并且这项研究中使用的试剂盒只能检测完整的抗体和Fab2片段，但无法检测Fab片段或其他/进一步降解了的IFX片段。另外，粪便经过了冷冻保存了几周才进行IFX浓度检测，因此，部分抗体降解不能排除在外。另外，考虑患者的依从性，以及减少小肠粘膜损伤的粪便IFX浓度的影响，本研究只纳入了回结肠型CD患者，且纳入患者数量较少，纳入中心单一，仍需更多临床治疗病例进一步证实IFX肠渗漏与IFX初治疗效的关系。

综上所述，肠内IFX的丢失在中重度CD与IFX初治无效有关。因此，重症患者可能可以从更大剂量的给药方案中，增加黏膜及血清IFX浓度从而获益。