LC-MS/MS同位素内标法测定鸡肉中氯霉素和金刚烷胺的残留量

胡 容，单长海

(恩施州公共检验检测中心，湖北 恩施 445000)

氯霉素属抑菌性广谱抗生素，用于治疗由伤寒杆菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、流感杆菌、布氏杆菌、肺炎球菌等引起的感染，对造血系统有严重不良反应，可能发生不可逆性骨髓抑制.氯霉素可透过胎盘屏障，对早产儿和足月产新生儿均可能引起毒性反应，发生“灰婴综合征”[1].氯霉素常被用于畜禽动物及水产品的疾病治疗和预防，但会造成动物源性食品中的药物残留[2].我国原农业部第235号公告中已将氯霉素列为不得检出药物.因此，氯霉素在畜牧产品中的残留对人类健康有很大风险.金刚烷胺属于三环氨类药物，对流感病毒有抑制作用，广泛用于畜禽养殖业，用来防止禽流感等疾病，但是，食用金刚烷胺类药后会产生呕吐以及神经紊乱症状等相对明显的副作用，而且其在体内降解代谢的量极微.若长期食用残留量高或被此类药物污染的食品，会在人体内富集，对中枢神经系统造成不良影响[3].原农业部公告第560号令中明确规定严禁在肉鸡生产中使用金刚烷胺.

目前，国家及各地市规定的监督检验中，动物源性食品中氯霉素类药物残留量检验方法主要采用GB/T 22338-2008《动物源性食品中氯霉素类药物残留量的测定》[4]，金刚烷胺主要采用GB 31660.5-2019《食品国家安全标准 动物源性食品中金刚烷胺残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》[5].在现有的研究报道中，检测动物源性食品中氯霉素类残留量[6-8]和金刚烷胺残留量[9-10]的方法较多，这些方法的不足之处在于检测目标过于单一，均为独立的前处理过程，同时测定氯霉素和金刚烷胺的前处理方法还未见报道，但是在动物源性食品的监督检验中，鸡肉样品一般都需要检测氯霉素和金刚烷胺两种化合物.因此，研究同时测定氯霉素和金刚烷胺两种化合物的前处理方法，对节省人力物力和检测时间具有紧迫意义.

对鸡肉样品中氯霉素和金刚烷胺两种化合物进行分析，采用乙腈作溶剂，并创造性的采用超声提取，经验证，提取效果好于传统的提取方式；采用冷冻离心、PSA和C18净化，LC-MS/MS同位素内标技术分析.本方法采用相同的前处理方法，分别用正模式和负模式进行仪器分析，在很大程度上节省人力和减少试剂耗材的消耗，方法稳定性好，回收率高，可满足鸡肉样品中氯霉素和金刚烷胺的分析.

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 主要仪器 TSQ Quantis液相色谱质谱联用仪(Thermo Fisher)；ST 40R离心机(Thermo Fisher)；Vac Elut SPS 24半自动固相萃取仪(安捷伦)；数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；氮气吹干仪(德翔)；RE-52AA旋转蒸发仪(上海昕仪)；MiLLi-Q纯水系统(美国MiLLipore公司)；Quintix 224-1cn电子分析天平(赛多利斯)；旋涡混合仪(北京方正公司).

1.1.2 主要试剂与样品 氯霉素标准品(纯度99.6%，ANPEL)；氯霉素-D5(纯度99.6%，ANPEL)；甲醇中盐酸金刚烷胺溶液标准物质(1 000 mg/L，农业农村部农产品质量标准研究中心)；甲醇中盐酸金刚烷胺-D15溶液标准物质(10 mg/L，农业农村部农产品质量标准研究中心)；甲醇(等级LC-MS，CNW)；乙腈、丙酮、正己烷(等级LC，CNW)；乙酸钠、乙酸铵(等级AR，国药集团化学试剂有限公司)；QuEChERS试剂(600 mg MgSO4,100 mg PSA,40 mg C18，CNW，SBE-CA8454-25).

鸡肉中金刚烷胺质控样(20.2 μg/kg，ANPEL)，鸡肉中氯霉素质控样(30.6 μg/kg，ANPEL)；鸡肉样品购于市场.

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液的配制 准确称取氯霉素50 mg(精确至0.1 mg)，置于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解定容，得质量浓度为500 mg/L的储备液；准确称取氯霉素-D510 mg(精确至0.1 mg)，置于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解定容，得质量浓度为100 mg/L的储备液.临用时，氯霉素-D5使用液配制成质量浓度为100 μg/L，氯霉素用基质溶液配置，质量浓度分别为0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、100.0 μg/L.金刚烷胺-D15(10 mg/L)临用时直接使用，金刚烷胺(1 000 mg/L)临用时用基质溶液配置配，质量浓度分别为2.0、4.0、10.0、20.0、100.0、200.0 μg/L.

1.2.2 样品处理 称取试样5 g(精确至0.01 g)，置于50 mL玻璃比色管中，加入100 μL氯霉素-D5(100 mg/L)工作溶液、100 μL金刚烷胺-D15(10 mg/L)和30 mL乙腈，加入2 g NaCl，旋涡混合30 s，超声提取10 min，转入离心管，4 ℃冷冻离心，6 000 r/min离心5 min.将上清液移入150 mL分液漏斗中，加入15 mL乙腈饱和的正己烷，振荡5 min，静置分层，转移乙腈层至100 mL棕色心形瓶中.残渣中再加入30 mL乙腈，旋涡混合30 s，超声提取10 min，转入离心管，4 ℃冷冻离心，6 000 r/min离心5 min.取上清液转移至同一分液漏斗，振荡5 min，静置分层，转移至同一棕色心形瓶中.向心形瓶中加入5 mL正丙醇，用氮气吹干，浓缩到10 mL左右时，加入QuEChERS试剂(100 mg PSA，40 mg C18)，旋涡混合2 min，10 000 r/min离心5 min，上清液转入干净离心管，氮气吹干，用1 mL水定容，定容液经过0.22 μm滤膜至进样瓶，待测定.

1.2.3 仪器检测条件

1)色谱条件

色谱柱为Agilent SB C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)，柱温30 ℃，进样量1 μL.氯霉素检测流动相为甲醇-0.1%乙酸铵水溶液，流速0.3 mL/min，梯度洗脱程序见表1.金刚烷胺检测流动相为甲醇-0.1%甲酸水溶液，流速0.3 mL/min，梯度洗脱程序见表2.

表1 氯霉素检测梯度洗脱程序

表2 金刚烷胺检测梯度洗脱程序

表3 定性离子对、定量离子对、碰撞能量和保留时间Tab.3 Qualitative ion pair,quantitative ion pair,collision energy and retention time

2)质谱条件

氯霉素检测质谱条件：电喷雾离子源；负离子扫描模式；多重反应监测(SRM)；电喷雾电压(2 500 V)；雾化气压(0.276 MPa)；气帘气压(0.172 MPa)；辅助气流速(0.206 MPa)；离子源温度(350 ℃).金刚烷胺检测质谱条件：电喷雾离子源；正离子扫描模式；多重反应监测(SRM)；电喷雾电压(3 500 V)；雾化气压(0.276 MPa)；气帘气压(0.172 MPa)；辅助气流速(0.206 MPa)；离子源温度(350 ℃).

2 结果与分析

2.1 质谱条件的确定

金刚烷胺和金刚烷胺-D15分子中含有氨基，在正离子模式下易形成[M+H]+准分子离子，氯霉素和氯霉素-D5在负离子模式下易形成[M-H]-准分子离子，在分析质谱条件时，配置标准溶液为1 mg/L，采用直接进样法，DEFINE SCAN模式扫描，OPTIMIZATION模式优化碰撞能量，质谱条件见表3，提取离子流色谱图见图1.

(a) 氯霉素 (b) 氯霉素-D5

(c) 金刚烷胺 (d) 金刚烷胺-D15图1 氯霉素、氯霉素-D5、金刚烷胺和金刚烷胺-D15提取离子流色谱图Fig.1 Extracted ion chromatogram of chloramphenico,chloramphenico-D5,amantadine and amantidine-D15

2.2 前处理条件的确定

提取溶剂的选择对提取的效果比较重要，以能够充分提取目标物和杂质的去除度为目标，试验采用鸡肉粉中氯霉素质控样和鸡肉粉中金刚烷胺的质控样为试验样品，选取乙酸乙酯和乙腈作为溶剂.结果显示，两种溶剂都能很好地提取目标物，但是乙酸乙酯提取杂质明显高于乙腈提取的杂质，因此，选取乙腈作为提取溶剂最佳.

表4 不同提取方式下氯霉素和金刚烷胺回收率Tab.4 Recovery rates of chloramphenicol and amantadine under different extraction methods

表5 超声提取不同次数下的氯霉素和金刚烷胺回收率Tab.5 Recovery rates of chloramphenicol and amantadine in different extraction times by ultrasound

表6 氯霉素、金刚烷胺标准曲线和决定系数Tab.6 Standard curves and determining factor of chloramphenicol and amantadine

表7 氯霉素和金刚烷胺测定的回收率和精密度Tab.7 Recovery and precision of chloramphenicol and amantadine

称取质控样5 g(精确到0.001 g)，加入乙腈30 mL，旋涡混合后，采用80 r/min震摇5、10、15、20 min和超声法超声5、10、15、20 min两种方式进行比较，超声法提取15 min，氯霉素回收率可达91.6%，金刚烷胺回收率可达89.6%，因此，超声法提取15 min为最佳提取方式.采用超声法提取15 min提取1、2、3次进行比较，提取2次基本能够提取完全，氯霉素回收率可达95.6%，金刚烷胺回收率可达93.9%，因此，最佳的提取方式为超声15 min提取2次.不同提取方式下氯霉素和金刚烷胺回收率结果见表4，不同提取次数氯霉素和金刚烷胺回收率结果见表5.

考虑到鸡肉样品基质影响较复杂，乙腈提取时加入2 g NaCl，起到抑制杂质溶解的作用，离心时采用4 ℃冷冻离心，降低杂质的溶解度，样品离心后合并两次提取液的上清液于鸡心瓶中，向心形瓶中加入5 mL正丙醇，用氮气吹干仪氮吹，浓缩到10 mL时，加入100 mg PSA，40 mg C18，旋涡混合2 min，10 000 r/min离心5 min，上清液转入干净离心管氮气吹干，用1 mL水定容，定容液过0.22 μm滤膜至进样瓶，待测定.

2.3 方法学验证

2.3.1 校准曲线 按照1.2.1的方法进行曲线分析，以目标物定量离子和相应内标物峰面积之比为横坐标，目标物质量浓度为纵坐标，绘制标准曲线.氯霉素在0.5～100.0 ng/mL范围内，金刚烷胺在0.5～100.0 ng/mL范围内，标准曲线良好，结果见表6.

2.3.2 检出限、回收率、精密度 检出限的测定采用低浓度加标法，本研究采用空白鸡肉样品添加氯霉素质量浓度0.05 μg/kg，金刚烷胺添加质量浓度为0.5 μg/kg，按照样品处理方式平行测定10次，采用经典公式MDL=S×t(n-1，1-a=0.99)计算检出限(LOD)[11]，按照约3倍检出限计算定量限(LOQ).经过计算，氯霉素和金刚烷胺的检出限(LOD)分别为0.03 μg/kg、0.3 μg/kg，氯霉素和金刚烷胺的定量限(LOQ)分别为0.1 μg/kg、1.0 μg/kg.

回收实验采用空白基质样品加标法，按照1倍定量限、10倍定量限、50倍定量限的水平添加标准物质，添加内标物质氯霉素-D5质量浓度为0.1 mg/L、金刚烷胺-D15为2 mg/L，添加量为100 μL，按照2.2的方法平行测定3次，精密度实验平行测定7次，检测结果见表7.从表7可以看出，两种物质回收率范围在75.4%～95.8%之间，精密度范围在1.6%～6.2%之间，满足兽药残留定量分析要求.

2.3.3 方法应用 对在市场上抽取的10批次鸡肉样品，利用本方法进行分析，其中有1批次检出金刚烷胺(2.1 μg/kg)，其余批次均未检出金刚烷胺和氯霉素.采用GB /T 22338-2008进行氯霉素分析，均未检出；采用GB 31660.5-2019对金刚烷胺进行分析，其中有1批次检出金刚烷胺(1.8 μg/kg).说明建立LC-MS/MS同位素内标法测定鸡肉中氯霉素和金刚烷胺残留量的方法准确可靠.

3 结论

通过优化仪器条件和前处理方法，并经过方法学验证，建立了超声提取LC-MS/MS同位素内标法测定鸡肉中氯霉素和金刚烷胺的残留量的方法.其检出限优于国家标准GB /T 22338-2008(氯霉素为0.1 μg/kg)和GB 31660.5-2019(金刚烷胺为1 μg/kg)，准确度和精密度验证结果符合GB/T 27417-2017《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》[12]，而且能够应用于鸡肉产品的氯霉素和金刚烷胺药物残留的同时检测，应用前景良好.