高亲和力大豆凝集素单抗制备及免疫学特性鉴定

胡骁飞 李燕虹 邢云瑞 胡思宇 孙亚宁 邢广旭 邓瑞广 张改平,4,*

(1 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002；2 河南科技大学食品与生物工程学院， 河南 洛阳 471003； 3河南农业大学生命科学学院，河南 郑州 450002；4河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州 450002)

大豆及其制品含有丰富的蛋白质资源，且营养成分利用效率高，是人类和动物的重要食品原料及饲料加工原料。但大豆中含有多种致敏蛋白和抗营养因子，这些物质的存在会影响大豆的有效利用[1]。大豆凝集素(soybean agglutinin，SBA)就是其中一种重要的抗营养因子[2]。SBA是一种能与N-乙酰基D-半乳糖胺/D-半乳糖特异性结合、分子量约为120 kDa的糖蛋白[3-4]。SBA具有凝集红细胞和促分裂的生物学活性，通过小肠上皮刷状缘进入循环系统诱发免疫反应[5-6]，引起动物小肠黏膜损伤、绒毛萎缩，胰腺增生，致使动物体蛋白分解增强，内源氮损失增加[7-9]。日粮中的SBA可以引起动物腹泻，导致生长速度下降，体重减轻，甚至导致动物死亡，严重威胁动物尤其是幼龄动物的健康生长与生命安全[10-11]。

为监控SBA的存在，减少其对动物的危害，科研人员建立了多种SBA的测定方法，如红细胞凝集试验[12]、免疫火箭电泳[13]及酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)等方法[14-15]。红细胞凝集试验中红细胞来源会影响试验的灵敏性，若红细胞选择不合理则检测灵敏性较低，而且红细胞来源不同可能导致检测结果重复性较差[16-17]。免疫火箭电泳法操作比较复杂，且需要特殊的仪器设备，不能进行现场实时监测，难以推广。与其他方法相比，ELISA检测方法[14]缩短了检测时间，但由于SBA是大分子蛋白质，含有多个抗原决定簇，因此更适合采用双抗体夹心ELISA方法进行测定。另外，多克隆抗体的成分不均一，采用多抗血清建立SBA间接竞争ELISA检测方法，其准确性与重复性较低；而单克隆抗体成分比较均一，且性能比多克隆抗体稳定，利用两种单克隆抗体或至少一种单克隆抗体与一种多克隆抗体进行配对建立双抗体夹心ELISA检测方法，其性能较稳定，且准确性及重复性较好[18-19]。张海全[15]制备出了SBA单克隆抗体，利用红细胞膜对SBA特异性吸附的性能，结合所制备的单抗建立了相当于双抗夹心ELISA的SBA检测方法，比间接竞争ELISA试剂盒检测结果更准确。但由于红细胞膜来源及制备时的纯净度不确定，且易受试验中试剂性质的影响，这种试剂盒检测的稳定性及重复性相对较差。ELISA检测耗时通常在2 h以上，还需酶标仪来读值，不能实现现场实时监测。广大食品生产及饲料加工、动物养殖企业迫切需要更简单快速的SBA检测方法。基于胶体金标记技术及免疫测流层析技术建立的快速检测试纸是目前食品饲料安全监控检测领域的研究热点，由于其简单快速，且符合我国食品安全快速筛查的要求，已广泛应用于农药[20]、兽药[21]、霉菌毒素[22]、细菌病毒[23]及过敏原等的检测[19]。试纸制备过程中由于需要抗体与胶体金或量子点结合，影响抗体生物活性，因此同一种抗体试纸目测灵敏性应远低于试剂盒灵敏性[24]。通常情况下，抗体亲和力越高，则灵敏性越好。为了研制准确率高、重复性好、灵敏性高的SBA免疫学检测试纸，必须研制高灵敏、高亲和力的SBA单克隆抗体。

本试验拟采用低剂量、多次免疫的方法，通过免疫小鼠、细胞融合及阳性杂交瘤筛选技术，筛选制备出亲和力高、灵敏性好、特异性强的SBA单克隆抗体，以期为建立稳定灵敏的SBA免疫学检测方法提供可靠的抗体保障，为大豆及其制品中SBA的监测提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SBA，大豆Kunitz胰蛋白酶抑制因子(kunitz trypsin inhibitor，KTI)，大豆Bowman-Birk胰蛋白酶抑制因子(bowman-birk trypsin inhibitor，BBI)，大豆球蛋白(glycinin)，β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)，弗氏完全佐剂(freund’s complete adjuvant， FCA)，弗氏不完全佐剂(freund’s incomplete adjuvant，FIC)，mAb分型试剂，购自美国Sigma-Aldrich公司。HAT(hypoxanthine-aminopterin-thymidine)培养基，HT(hypoxanthine-thymidine)培养基，RPMI-1640，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)蛋白Marker，酶标羊抗鼠IgG抗体(GaMIgG-HRP)，硝酸纤维(nitrocellulose，NC)膜，购自索莱宝(北京)生物科技公司。ELISA包被液[0.05 mol·L-1碳酸盐缓冲液(carbonate buffer solution，CBS)]，稀释液[0.01 mol·L-1磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)]，封闭液[含5%脱脂奶的PBST(含0.05% Tween-20的PBS)溶液]，显色液[磷酸-柠檬酸缓冲液(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine, TMB)]，终止包被液(2 mol·L-1的H2SO4溶液)等溶液均由实验室配置。其他试剂均为市售分析级试剂。

6～8周龄洁净级雌性BALB/c小鼠，购自郑州大学医学院动物实验中心。小鼠NS0骨髓瘤细胞由英国国家动物健康研究院惠赠。

1.2 主要仪器与设备

TMQC型台式高压蒸汽灭菌器，新华医疗器械有限公司；iMark 450/550酶标仪、Trans-Blot转膜系统，美国Bio-Rad公司；BCM-1000A型生物洁净工作台，AIRTECH苏净安泰有限公司；DMI 3000型倒置生物显微镜，德国Leica光学仪器公司。

1.3 试验方法

1.3.1 小鼠免疫 取4只健康雌性BALB/c小鼠，以50 μg SBA蛋白/200 μL乳化液/只的剂量免疫小鼠，共免疫4次，免疫间隔21 d。首次免疫，取500 mg·L-1SBA溶液600 μL，加入等体积的FCA(考虑乳化过程免疫原的损失，因此增加50%的量)，完全乳化后背部皮下4～6点注射。后3次强化免疫，用FIA替代FCA，其他条件不变。

1.3.2 多抗血清鉴定 第4次免疫10 d后，小鼠断尾采血，制备多抗血清，采用ELISA方法对血清效价及灵敏性进行测定[18]。间接ELISA测定效价时，以满足P≥0.2且P/N值≥2.1条件时，最小P值对应的血清稀释倍数为血清效价，其中P为阳性孔OD450值，N为阴性孔(阴性孔中加入未经SBA免疫的小鼠血清)OD450值。间接竞争ELISA与间接ELISA步骤有所不同，首先将含2 500、2 000、1 500、1 000、500、250、125和0 μg·L-1的SBA标准液各50 μL分别加入包被有SBA的酶标板孔中，然后每孔加入50 μL效价测定时OD450值为1.0左右的血清稀释液，其余步骤与间接ELISA一致，根据酶标仪读值，以B/B0(B为不同浓度SBA对应的OD450值，B0为0 μg·L-1SBA对应的OD450值)为纵坐标，SBA浓度对数为横坐标建立抑制曲线，计算半数抑制浓度(50% inhibitory concentration, IC50)，以此衡量血清灵敏性。选取血清效价高，灵敏性好的小鼠作为细胞融合小鼠。

1.3.3 杂交瘤细胞株的建立 细胞融合前3 d，对筛选用来融合的小鼠进行超强免疫1次，腹腔注射200 μL含50 μg SBA灭菌PBS溶液。抻颈处死超免小鼠，70%酒精浸泡5 min，超净台无菌取出小鼠脾脏，并与提前复苏培养的NS0细胞进行融合，将融合后的细胞加入96孔细胞培养板进行培养，7～10 d(根据细胞生长情况)后取上清液，进行阳性杂交瘤筛选。具体细胞融合步骤及阳性杂交瘤细胞筛选过程参照文献[25-26]的方法进行。

1.3.4 SBA mAb大量制备 采用体内诱生腹水法大量制备SBA mAb。将0.5 mL/只灭菌液体石蜡注射到小鼠腹腔中，7 d后，用RMPI-1640稀释阳性杂交瘤细胞至1×106个·mL-1，以0.5 mL/只的剂量注射入上述小鼠腹腔内。观察小鼠腹部肿胀情况，待腹部肿胀明显时采集腹水，将腹水5 000 r·min-1离心10 min，弃沉淀留上清，分装后于-80℃保存备用。

1.3.5 SBA mAb免疫学特性鉴定

效价测定：间接ELISA方法测定SBA mAb效价。

亚型鉴定：按照Sigma鼠源mAb分型试剂盒说明书测定。

亲和力常数(Ka)测定：ELISA饱和法测定[24]，根据公式进行计算：

Ka=(n-1)/2(n[Ab’]t-[Ab]t)

(1)

式中，n为[Ag]t与[Ag’]t的比值；[Ag]t、[Ag’]t为不同包被浓度；[Ab]t、[Ab’]t为2个不同包被浓度下抗体50%半饱和对应的浓度。

特异性鉴定：交叉反应率测定，将glycinin、β-conglycinin、BBI、KTI作为抑制剂，通过间接竞争ELISA测定IC50，计算交叉反应率[(cross reaction rate, CR)CR=SBA的IC50/其他竞争物的IC50×100%][27]。Western blot鉴定，将glycinin、β-conglycinin、BBI、KTI分别以相同的浓度及体积加入SDS-PAGE凝胶泳道中(每个样品2个重复)，电泳结束后一部分用于考马斯亮蓝染色并脱色观察；另一部分转膜后，加入抗体于37℃条件下孵育2 h，经PBST洗涤30 min，再于室温下与酶标二抗GaMIgG-HRP结合2 h，经PBST洗涤后超免ECL化学发光显色液显色，将显色结果与SDS-PAGE结果进行比对，判断SBA mAb的特异性[19]。

2 结果与分析

2.1 小鼠多抗血清的鉴定

由表1可知，经过4次免疫， 4只小鼠免疫效果良好，均产生了SBA抗体，效价均在1∶6 400 以上，其中1、2、3号小鼠效价均达到1∶12 800以上。

表1 多抗血清效价的间接ELISA测定结果Table 1 Titer of mouse antiserum detected by indirect ELISA

4只免疫小鼠产生的抗体，均可以被SBA抑制，其中1号小鼠抑制效果最好(图1)。根据1号小鼠多抗血清抑制曲线计算其IC50为571.4 μg·L-1。说明本研究采用的SBA免疫剂量、免疫方式是成功的。

2.2 SBA mAb的制备及特性鉴定

根据免疫小鼠多抗血清效价及灵敏性鉴定结果，选择血清效价高、灵敏性好的1号小鼠进行细胞融合。经过有限稀释亚克隆，最终得到1株能稳定分泌抗SBA单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株，命名为5B4E10。通过小鼠体内诱生腹水法批量制备出SBA单克隆抗体。

2.2.1 SBA mAb效价 由表2可知，所制备的SBA单抗抗体效价比较高，达到1∶409 600以上。

图1 1号小鼠血清的抑制曲线Fig.1 Serum inhibitive curve of No.1 mouse

表2 SBA mAb效价测定Table 2 Determination of the titer of SBA mAb

2.2.2 SBA mAb亚型 SBA mAb亚型鉴定结果见图2。结果表明，制备的SBA mAb亚型为IgG1型。

2.2.3 SBA mAb亲和力 SBA mAb的亲和力曲线见图3。经计算，与5 和2.5 mg·L-1浓度的SBA抗原结合并达到50%饱和状态时所对应SBA mAb浓度分别为739.55 和415.40 μg·L-1，根据公式计算Ka为1.83×109L·mol-1，而一般认为Ka介于107～1012L·mol-1时属于高亲和力抗体[28]，亲和力越高，说明以此抗体制备的检测产品灵敏性越好。

图2 SBA mAb亚型鉴定Fig.2 Identification of subtype of SBA mAb

图3 SBA mAb亲和力曲线Fig.3 Affinity curve of SBA mAb

2.2.4 SBA mAb灵敏性 SBA mAb灵敏性测定结果见图4。抑制回归曲线方程为y=-0.329 8x+1.131 2，R2=0.979 5，由回归曲线计算IC50为82.04 μg·L-1。说明SBA mAb具有很高的灵敏性。这可能是由于抗体的亲和力比较高，更易与靶标物质结合。

图4 SBA mAb的抑制曲线Fig.4 Inhibitive curve of SBA mAb

2.2.5 SBA mAb特异性 由表3可知，SB mAb与glycinin、β-conglycinin、BBI、KTI的CR均小于1%，说明4种竞争物与SBA mAb无交叉反应性，SBA mAb的特异性比较强。

表3 SBA mAb的交叉反应结果Table 3 The cross-reactivity of SBA mAb

由图5-A可知，SDS凝胶电泳时，大豆过敏原glycinin及β-conglycinin，抗营养物质SBA、BBI、KTI均有条带出现，说明胶片上有该种物质存在。由图5-B可知，SDS凝胶电泳胶片转膜到NC膜上与SBA mAb反应时，只有SBA条带还存在，而glycinin、β-conglycinin、BBI及KTI的条带均消失，说明SBA mAb只能与SBA结合，不与其他4种物质结合，进一步证明了SBA mAb的特异性较强。

Note: 1: Marker. 2: glycinin. 3: β-conglycinin. 4: BSA. 5: BBI. 6: KTI.图5 SBA mAb Western blot鉴定Fig.5 Western blot identification of SBA mAb

3 讨论

SBA分子量约120 kDa，属于大分子抗原物质，与农药、兽药、霉菌毒素等小分子半抗原物质不同，小分子半抗原必需与载体蛋白偶联形成人工完全抗原才能够刺激动物机体产生抗体[21, 29-30]。 而SBA不需要与载体蛋白偶联就可以直接刺激动物机体产生抗体，因此本试验直接将SBA经过乳化后免疫动物用来制备抗体。有研究用大豆球蛋白glycinnin和β-conglycinin直接免疫小鼠和兔子成功制备出了二者的单克隆抗体和多克隆抗体[25]。

抗原免疫剂量并非越高越好，大剂量免疫不但浪费抗原增加成本，而且所制备抗体的效价及灵敏性并不一定比低剂量组高[31-32]。王耀[25]以50 μg SBA蛋白剂量用glycinin和β-conglycinin免疫小鼠，取得了良好的免疫效果；本研究同样用50 μg SBA蛋白的剂量对小鼠进行免疫，所用剂量比张海全[15]研究选用剂量低60%，但本研究制备的单抗亲和力常数(Ka)比张海全[15]制备的单克隆抗体高出近两个数量级(109∶107)，这可能是由于本研究采用4次免疫，而张海全[15]的研究选用的是3次免疫，表明低剂量、多频次免疫可能更利于高亲和力抗体形成。亲和力高的抗体，其灵敏性也较好，本研究中所制备单抗敏感性较好，其IC50为82.04 μg·L-1，而张海全[15]报道中未提及抗体灵敏性，如果从抗体的亲和力来推算，本研究制备抗体的灵敏性更好一些，而亲和力高、灵敏性好的单抗更易于制备出高灵敏的免疫学检测产品。本研究制备的抗体亚型为IgG1型，张海全[15]制备的SBA单克隆抗体亚型是IgG2型，二者之所以不同，可能是由SBA免疫剂量、免疫次数及免疫间隔不同引起的，张海全[15]所用SBA免疫剂量为80 μg蛋白，免疫间隔为28 d，免疫3次；而本研究所用SBA免疫剂量为50 μg蛋白，免疫间隔21 d，免疫4次。本研究制备的SBA抗体亚型与王耀[25]制备的glycinin 和β-conglycinin抗体亚型一致，均为IgG1型，而两项研究除了靶标不同外，所采用的免疫剂量、免疫间隔及免疫次数均相同。

4 结论

本试验通过将纯化的SBA免疫BALB/c小鼠，在鉴定小鼠多抗血清效价和灵敏性的基础上，选择效价和灵敏性较优的小鼠进行细胞融合，阳性杂交瘤筛选，有限稀释亚克隆成功，从而得到1株能分泌抗SBA单克隆抗体的稳定杂交瘤细胞株5B4E10，其分泌的SBA mAb效价达到1∶409 600以上，亚型为IgG1型，Ka为1.83×109L·mol-1，且只与SBA特异性结合，而不与其他大豆过敏原或抗营养因子结合。本试验制备出了免疫学特性良好的SBA单克隆抗体，为建立大豆及其制品中SBA的高灵敏免疫学检测方法奠定了良好的基础。