ACE2激动剂对大鼠放射性心脏损伤的保护作用研究

师勤莹，张国良，李 蓉，杨 欣，王 琳，宋建波

放射治疗是恶性肿瘤的主要治疗手段，多项研究证实，乳腺癌、霍奇金淋巴瘤、食管癌、肺癌等胸部肿瘤病人接受放射治疗后，心脏不可避免受到一定剂量/体积照射，发生放射性心脏损伤，可增加肿瘤病人心血管系统疾病发病率和死亡率，部分抵消放射治疗带来的生存获益[1-3]，因此，需要临床肿瘤医生高度关注并及时干预，改善病人预后及生存质量。肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)是机体重要的体液调节系统，多项研究显示，RAS在放射性心脏损伤发生发展中有重要作用[4-5]。血管紧张素转换酶2(ACE2)是RAS系统的新成员，其主要生理功能是高效催化血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)转化为血管紧张素1-7(Ang1-7)，对RAS系统经典轴血管紧张素转化酶(ACE)/AngⅡ/AT1进行负调节，可发挥保护心血管的作用[6]，近年来引起越来越多学者关注。有研究发现，抗锥虫药乙酰甘氨酸重氮氨苯脒(DIZE)是ACE2的内源性激动剂，能提高ACE2活性，改善高血压、心肌梗死、糖尿病心肌病、心律失常等疾病导致的心脏结构和功能异常，保护心脏[7-10]。本研究探讨DIZE对大鼠放射性心脏损伤的作用及其机制，从而为临床放射性心脏损伤的防治提供新思路及参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 取健康成年雄性SD大鼠60只，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，体重250～300 g，均给予标准大鼠饲料和洁净自来水，自由摄取。将大鼠随机分为3组(每组20只)，对照组：不照射；照射组：心脏接受20 Gy照射；DIZE组：心脏接受20 Gy照射，在照射前1周至照射后1个月，每日给予皮下注射DIZE 15 mg/kg。每组实验大鼠分别在照射后3个月及6个月随机选择10只处死，进行血清酶联免疫吸附法测定(ELISA)、组织病理及反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测。

1.2 大鼠放射性心脏损伤模型构建 照射组及DIZE组大鼠麻醉后取仰卧位，将四肢固定于自制木板上。射野大小为2.5 cm×2.5 cm，上界为胸骨角下缘，下界为上界向剑突方向下移2.5 cm，左界以中线向左旁开1.5 cm，右界为中线向右旁开1.0 cm。制作铅块以保护肺及腹部器官，位置验证后，以直线加速器照射，6 mV的X线，照射剂量20 Gy，剂量为300 cGy/min，源皮距100 cm，剂量计算点深度2.5 cm。对照组鼠不进行照射。

1.3 ELISA检测大鼠血清AngⅡ、Ang1-7水平 严格按照试剂盒说明书准备，加入样品和标准品，37 ℃水浴锅温浴60 min；重复洗板3次；将底物A、B按要求加入每孔中，37 ℃避光孵育15 min。重复洗板5次；每孔加入终止液50 mL，15 min内在450 nm波长处测定各孔光密度OD值。

1.4 组织病理检测

14.1 苏木精-伊红(HE)染色 大鼠心肌组织常规脱水、透明、包埋、切片，厚4 μm，HE染色，中性树胶封片，光镜下观察心肌及间质形态变化。

1.4.2 CD31免疫组化染色 心肌组织切片常规脱蜡、水化及封闭内源性过氧化物酶活性，按照检测试剂说明书，滴加CD31一抗4 ℃恒温过夜，依次滴加试剂1(聚合物辅助剂)、试剂2(辣根酶标记抗山羊IgG多聚体)，DAB显色，CD31阳性细胞呈棕色或褐色颗粒。显微镜下观察CD31阳性细胞表达情况，计数单位面积内CD31阳性微血管数量(×200)，随机选取5个视野，计算平均值，即得到微血管密度(MVD)。CD31阳性微血管计数标准：单个内皮细胞、内皮细胞簇、微小血管均计数，有较厚肌层区域的血管不计数。

1.4.3 Masson染色 取心肌组织以10%甲醛固定，石蜡包埋后制备5 μm切片，脱蜡至水化，Masson染色后，常规脱水透明，中性树胶封固。通过全自动图像分析系统对胶原进行定量分析，计算间质胶原容积分数(CVF)。

1.5 RT-PCR检测心肌组织ACE2和ACE mRNA表达 按试剂盒说明以TRIzol®试剂(9108，TaKaRa，Japan)提取心肌组织总RNA。根据试剂盒提供的方案合成cDNA。引物由invitrogen公司设计并合成(引物序列见表1)。各组设置3个复孔，记录各孔CT值，并采用2-△△CT对结果进行分析。详见表1。

表1 各基因引物序列

2 结 果

2.1 大鼠一般情况 所有实验大鼠均顺利完成整个实验过程。照射后3个月及6个月，照射组及DIZE组大鼠胸部及背部照射视野皮肤出现轻度脱毛，各组大鼠饮食、体重、精神状态无明显差异。

2.2 大鼠血清ELISA检测结果 照射后3个月及6个月，照射组AngⅡ水平增高，DIZE干预后AngⅡ水平降低；与对照组比较，照射组Ang1-7未发生明显改变，照射后6个月DIZE组Ang1-7增高。详见图1。

与同时间对照组比较，*P<0.05；与同时间照射组比较，#P<0.05。图1 各组血清AngⅡ、Ang1-7比较

2.3 各组大鼠心肌细胞HE染色结果 与对照组比较，照射后3个月，照射组及DIZE组大鼠心肌细胞出现水肿，排列紊乱，外膜下炎症细胞浸润，间质改变不明显；照射后6个月，照射组心肌损伤进一步加重，心肌细胞出现水肿、空泡、溶解及萎缩改变，间质纤维组织增生，DIZE组大鼠心肌损伤较照射组减轻。详见图2。

图2 各组大鼠心肌细胞HE染色图像(×200)

2.4 CD31免疫组化染色结果 照射后3个月，照射组MVD较对照组明显增加(P=0.01)，DIZE组MVD较照射组降低(P=0.015)；照射后6个月，与对照组比较，照射组和DIZE组MVD增高(P<0.01)；与照射后3个月相比，照射组照射后6个月大鼠心肌MVD未进一步增加(P=0.77)，DIZE组MVD增加(P=0.01)。详见表2。

表2 各组大鼠心肌MVD比较(±s) 单位：个/mm2

2.5 Masson染色结果 照射后3个月及6个月，照射组较对照组CVF均明显增加(P<0.01)，DIZE组CVF均低于照射组(P<0.01)，高于对照组(P<0.01)。详见表3。

表3 各组大鼠心肌CVF比较(±s) 单位：%

2.6 RT-PCR心肌ACE mRNA、ACE2 mRNA检测结果 照射后3个月，照射组和DIZE组ACE mRNA表达较对照组降低(P<0.05)；照射后3个月及6个月，DIZE组ACE2 mRNA表达明显高于照射组及对照组，照射组和对照组ACE2 mRNA表达比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见图3。

与同时间对照组比较，＊P<0.05；与同时间照射组比较，# P<0.05。图3 各组大鼠心肌ACE、ACE2mRNA表达比较

3 讨 论

放射性心脏损伤目前尚无特异有效的防治方法，一级预防是指改进放疗方案以减少心脏受照剂量/体积。随着现代精确放疗技术的应用，如呼吸门控技术、三维适形放射治疗、调强放射治疗、容积弧形调强放射治疗、质子放射治疗等，心脏受照剂量/体积较二维放疗时代明显减小，放射性心脏损伤发病呈下降趋势，但心脏受照射不能完全避免，仍有部分心脏接受一定的剂量/体积照射[11]。因此，二级预防(随访和药物治疗)是至关重要的[12]。

本研究结果显示，大鼠心脏照射后3个月及6个月AngⅡ水平增加，心肌损伤随着时间延长呈进行性加重，这与相关文献报道[4-5，13]一致。阻断AngⅡ可能是治疗放射性心脏损伤的重要手段。目前，临床研究较多的是血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI)和血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂(angiotensin receptor blocker，ARB)，这两类药物理论上可抑制AngⅡ的产生及其生物学效应，起到保护心肌的作用。已有研究发现，ACEI及ARB可缓解心、肺、脑的放射性损伤[14-16]。Salata等[4]研究发现，大鼠放化疗后心脏ACE表达下调。本研究结果显示，大鼠心肌照射后AngⅡ水平升高，而心肌组织ACE表达照射后3个月下调，照射后6个月与对照组相比未发生明显改变。Yarom等[17]应用卡托普利虽然减少了大鼠放射性心脏损伤心肌纤维化和左室毛细血管密度下降，但未阻止心功能进行性下降。推测原因可能是存在非ACE依赖的AngⅡ生成途径，ACEI对AngⅡ抑制是不完全的，长期服用ACEI后体内AngⅡ水平逐步升高，产生ACE逃逸现象[18]，不能充分发挥保护心脏的作用。

RAS系统另外一个轴ACE2/Ang(1-7)/线粒体组装受体的发现为放射性心脏损伤治疗提供了新的靶点和思路，ACE2是该途径的中心成分。相关研究显示，心血管系统疾病的发生与ACE2、Ang1-7水平降低有关；ACE2基因的缺失导致AngⅡ水平增加、心脏缺氧诱导基因上调、血管炎性因子增加、胶原纤维沉积增多等，恶化高血压、心肌梗死、冠状动脉粥样硬化、糖尿病心肌病等所致心功能障碍，增加了ACE2活性，进而改善心脏功能[19-20]。目前常用的ACE2激动剂有DIZE和呫吨酮(Xanthenone，XNT)，与呫吨酮相比，DIZE具有较好的生物利用度、药理作用和理化性质。Badae等[21]发现DIZE较ACEI能较好地恢复急性心肌梗死小鼠心功能。本研究中实验大鼠心脏照射前至照射后1个月注射DIZE，可促进大鼠心肌ACE2表达，降低血清AngⅡ水平，增加Ang1-7，增加微血管密度，降低间质纤维化，改善心肌损伤。与以往文献报道[22-24]心血管病变所致心肌损伤后ACE2及Ang1-7降低不同的是，本研究照射后3个月及6个月照射组大鼠心脏ACE2 mRNA、Ang1-7水平均未发生明显改变，结合同期病理检测，推测原因是ACE2主要表达于内皮细胞而非心肌细胞，照射后心肌微血管密度代偿性增加，可抵消内皮损伤导致的ACE2表达降低，Ang1-7未发生明显改变。照射后6个月DIZE组ACE表达与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；照射后6个月DIZE组心肌ACE表达较照射组呈下降趋势，间接体现了DIZE对心肌的保护作用，心肌损伤减轻，间接抑制ACE的激活。

本研究中大鼠心肌受照后MVD呈代偿性增加，但与照射后3个月比较，照射后6个月MVD未进一步增长；间质纤维化及心肌细胞损伤随时间延长呈进行性加重。DIZE组MVD随时间延长呈进行性增加，心肌间质纤维化及心肌细胞损伤较照射组明显减轻。结合相关研究内皮细胞过表达ACE2可刺激内皮细胞迁移和成管能力[25]，推测DIZE能保护放射性心脏损伤的内皮细胞，促进照射心肌微血管生成，增加血流灌注，减轻间质纤维化，保护受照射的心肌。

综上所述，ACE2激动剂DIZE可促进放射性心脏损伤大鼠心肌ACE2表达，降低AngⅡ水平，增加血清Ang1-7，保护内皮细胞，降低间质纤维化，改善心肌损伤，可能是治疗放射性心脏损伤的有效药物。