香烟烟雾提取物对可溶性内皮细胞蛋白C受体表达的影响

樊芳芳，胡晓芸

蛋白C系统作为人体抗凝系统的重要组成部分，在血液中以无活性的酶原形式存在，保持正常机体凝血与抗凝功能平衡[1]，是体液抗凝的主要成分之一。蛋白C系统参与抗凝的不同阶段，不仅影响蛋白C活化，而且抑制活化蛋白C活性[2-3]。Fukudome等[4]从内皮细胞表面分离出蛋白C和活化蛋白C的结合蛋白——内皮细胞蛋白C受体(endothelialcellprotein C receptor，EPCR)，其存在于细胞膜表面的跨膜蛋白，与蛋白C/活化蛋白C特异性结合后将其呈递给邻近的凝血酶/血栓调节蛋白复合物，使蛋白C活化效率提高5倍，同时参与调节血液凝固反应。EPCR有两种存在形式，一种是内皮细胞表面的膜联EPCR(mEPCR)，通过与蛋白C结合增强蛋白C/活化蛋白C活性，提高蛋白C活化率[5]，但其本身无任何直接的抗凝活性；另一种是存在于血浆的可溶性EPCR(sEPCR)，其作用是抑制蛋白C/活化蛋白C活性[5-6]。相关研究发现，血浆sEPCR升高可增加动静脉血栓形成风险[6-7]。本研究将香烟烟雾提取物(CSE)作用于人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，观察CSE对sEPCR表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 HUVECs株为ATCC来源细胞株，购自上海门谍塔生物科技发展有限公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自杭州四季青公司；RPMI-1640培养基、HEPES、胰蛋白酶均购自Gibco；青霉素、链霉素均购自华北制药股份有限公司；人sEPCR酶联免疫吸附法测定(ELISA)试剂盒购自上海西唐公司。

1.2 CSE的制备 参照文献[8]方法，将1个50 mL注射器驱动装置连续抽吸两支过滤嘴香烟，每支烟吸5 min，以-5 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)负压持续吸引，经三通管另一负压驱动出口将产生的烟雾溶于50 mL磷酸缓冲盐溶液(PBS)制成悬液[5]，将获得的CSE溶液通过0.22 μm微孔滤膜过滤，以除去细菌和大颗粒。将CSE-PBS缓冲液以1 mol/L的NaOH调节pH值至7.4，并将获得的储备溶液浓度定义为100%的CSE，并使用PBS将溶液稀释至实验所需的最终浓度。每次实验前立即准备CSE溶液。

1.3 HUVECs培养与分组 将含10%FBS的RPMI-1640培养液与HUVECs共同孵育，培养箱条件为37 ℃、5%CO2，48 h换液1次，观察细胞生长状态，当生长至亚融合状态，以0.25%的胰蛋白酶消化液1∶2传代，将传代的细胞接种于培养板上，每孔约2 mL，待细胞约80%融合后可用于实验[5]。实验分为以下两部分，①不同浓度CSE作用：分别将0%、2.5%、5.0%及10.0%的CSE与HUVECs共同孵育，8 h后收集各浓度组上清液。②同一浓度不同作用时间CSE对细胞的影响：将选出的5.0%CSE与HUVECs分别孵育0 h、4 h、8 h、12 h及24 h，并设立对照组，对照组采用相同体积的PBS同步培养，分别收集各组上清液。实验需保证各组除处理因素外其余实验条件均相同。每个样本均设4个复孔，实验重复3次[1]。

1.4 ELISA检测sEPCR含量 sEPCR标准品浓度分别为4 000 pg/mL、2 000 pg/mL、1 000 pg/mL、500 pg/mL、250 pg/mL、125 pg/mL、62.5 pg/mL，检测过程严格按照试剂盒说明进行。

较采用单因素方差分析(ANOVA)及重复测量方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HUVECs形态观察 倒置相差显微镜下观察HUVECs，可见细胞大量贴壁生长，形态不规则，呈椭圆形、多角形、扁平或梭形，为单层鹅卵石镶嵌样排列，细胞单层融合时呈典型的“铺路石”样外观。详见图1。

图1 HUVECs显微镜下图像

2.2 不同浓度CSE对HUVECs表达sEPCR的影响 HUVECs与不同浓度CSE孵育8 h后，5.0%、10.0%CSE组sEPCR较0%CSE组升高，差异有统计学意义(P<0.05)；2.5%CSE组与0%CSE组sEPCR比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 各组sEPCR比较(±s) 单位：pg/mL

2.3 同一浓度不同作用时间CSE对sEPCR的影响 显微镜下图像可见10.0% CSE组大部分细胞已死亡，故本研究实验采用5.0%CSE。5.0%CSE与HUVECs分别孵育0 h、4 h、8 h、12 h及24 h后，8 h、12 h及24 h sEPCR表达较对照组升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 同一浓度不同作用时间CSE对sEPCR的影响(±s) 单位：pg/mL

3 讨 论

血管内皮是人体重要的组成部分，相关研究已发现其具有多种生理功能，可维持血管通透性、调节白细胞和血小板黏附、维持血管细胞增殖、抗凝等作用，血管内皮既是血液和组织之间的天然屏障，也是人体最大的自分泌和旁分泌器官[1，9]，能合成和分泌多种抗凝和促凝因子，对维持凝血系统的平衡具有直接或间接作用，是血栓形成中重要的调节物质。血管内皮对血液成分和血流变化敏感，较多因素和相关疾病如吸烟、高脂血症、高血压、糖尿病等均可引起血管内皮功能障碍[1，10-11]，导致凝血和纤溶功能失衡。其中吸烟是重要的危险因素之一。

香烟烟雾包含超过5 600个不同成分[12]，其中200多个确定为致癌物和呼吸道毒素。吸烟是心血管疾病的独立危险因素，导致血管内血栓形成，与急性冠脉综合征和心源性猝死发生率增加有关[13]。尸检和临床研究表明，吸烟对受损的内皮细胞具有直接毒性作用，对动脉血栓的形成有重要作用，导致止血系统改变，血小板反应性增加，与动脉粥样硬化血栓形成有关[14-15]，血栓形成受抗凝和止血系统影响。然而，吸烟通过抗凝系统引起血栓形成的机制尚不清楚[16]。

血液凝血是一系列酶促连锁反应过程，其中高分子激肽原、因子Ⅴ和因子Ⅷ是血液凝血过程的限速因素。蛋白C系统是针对因子Ⅴ和因子Ⅷ的抑制物，在人体抗凝过程中发挥重要作用，凝血酶激活凝血过程，引起血小板活化，与内皮细胞表面血栓调节蛋白结合后，启动蛋白C抗凝系统。活化蛋白C一方面与辅因子蛋白S结合，灭活因子Ⅴa和Ⅷa，限制凝血酶产生；另一方面通过加速溶解组织纤维蛋白溶解酶原依赖性血凝块，从而发挥纤溶作用。EPCR是体内蛋白C系统新发现的成员[17]，可选择性地表达于大血管内皮细胞，不仅与蛋白C和活化蛋白C特异结合，提高蛋白C活化效率，还参与防御炎症反应和抗凋亡等过程，是近年来发现的在炎症和抗凝过程中具有重要意义的多功能糖蛋白[18]。EPCR分为两种，一种是内皮细胞表面的膜联EPCR，一种是血浆中sEPCR，两者对蛋白C/活化蛋白C的亲和力相同，但作用相反，sEPCR抑制蛋白C/活化蛋白C活性，抑制活化蛋白C对凝血因子Ⅴa和Ⅷ的灭活作用。

EPCR表达具有组织特异性，在胎盘、肝、肺和心肌组织呈高表达[1，19]，表明血管内皮细胞EPCR表达水平与组织发生血栓概率有关。故本研究选择HUVECs作为细胞模型，通过观察不同实验条件CSE对体外培养的HUVECs表达sEPCR含量变化[1]，从细胞水平揭示吸烟对血管内皮凝血功能的影响[16，20]。有研究表明，CSE呈剂量依赖性降低HUVECs存活率[1，21]。本研究结果显示，10.0%CSE组HUVECs存活率与0%CSE组相比明显下降，而5.0%CSE对HUVECs存活率基本无影响，5.0%、10.0%CSE与细胞共同孵育后，与0%CSE组相比，上清液sEPCR明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，5.0%与10.0%CSE比较差异无统计学意义(P>0.05)，2.5%CSE组与0%CSE组相比，sEPCR表达下降，但差异无统计学意义(P>0.05)，说明高浓度CSE与细胞共同孵育后，引起内皮细胞部分死亡，而低浓度CSE对内皮细胞的损害不大，与以往研究结果[1，22]一致。因此，本研究采用5.0%CSE为最佳浓度，以最佳浓度CSE孵育细胞，观察不同时间后sEPCR含量变化，结果显示：随着时间延长，上清液sEPCR含量逐渐增高，且不同时间5.0%CSE组sEPCR蛋白含量均高于对照组，其中8 h、12 h及24 h sEPCR表达较对照组升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示CSE对HUVECs表达sEPCR的影响在一定范围内呈时间依赖性。

综上所述，内皮细胞损伤与CSE作用密切相关，CSE导致sEPCR升高，抑制蛋白C/活化蛋白C活性，引起凝血功能障碍，从而导致血栓性疾病的发生，本研究为进一步探讨血栓性疾病提供了实验基础。