电针对脊髓损伤大鼠P2X4、IL-1β表达的影响

冀丽丽 李奕琴 付海城 倪广宝 周建瑞

摘要：目的观察电针对脊髓损伤大鼠模型痛行为及脊髓水平小胶质细胞（P2X4）和白介素-1β（IL-1β）表达的影响，为针刺防治脊髓损伤后中枢性疼痛的临床治疗提供依据。方法雄性SD大鼠40只，随机分为正常组、模型组、假手术组、电针组，每组10只。建立脊髓损伤大鼠模型，电针组取双侧腰1“夹脊穴”、“委中”，每天1次，每次20min，共治療7 d。测定大鼠热刺激爪退缩阈值、机械缩爪阈值，用RT-PCR技术检测大鼠脊髓P2X4mRNA及IL-1βmRNA的表达变化。结果脊髓损伤大鼠痛阈上升，脊髓水平P2X4mRNA及IL-1βmRNA表达增加。与模型组相比，电针组可以改善热痛阈、刺痛阈（P<0.05），抑制脊髓P2X4及IL-1β表达（P<0.05）。结论电针能抑制脊髓小胶质细胞活化及炎性因子的分泌从而发挥镇痛效应。

关键词：电针;脊髓损伤;中枢性疼痛;P2X4;白介素-1β（IL-1β）

【中图分类号】R   【文献标识码】A    【文章编号】1673-9026（2020）04-036-03

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）对上、下行神经通路的神经创伤会导致感觉和运动控制受损[1]，患者常并发中枢性疼痛[2]，属于病理性疼痛，表现为剧烈的、阵发性的、难以忍受的疼痛，给患者带来极大地痛苦，严重影响生活质量。P2X4是脊髓小胶质细胞表面受体之一，在脊髓损伤后P2X4受体表达的迅速上调。炎症因子白介素1β[3]（ Interleukin-1β，IL-1β） 在神经病理性疼痛的发生和发展中起着关键作用。本实验旨在研究电针对脊髓损伤后中枢性疼痛大鼠机械痛阈和热痛阈以及脊髓水平P2X4和IL-1β表达的影响，为针灸治疗脊髓损伤后出现的中枢性疼痛临床提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物

健康Sprague-Dawley（SD）大鼠40只，雄性，3月龄，体重（300±20）g，SPF级。购于湖北医药学院动物实验中心。大鼠适应性饲养5天后进行实验。饲养室及行为学实验室温度为23-25 ℃，湿度50±10%，每日早晨8：00至20：00开灯，20：00至次日8：00熄灯。

1.2 造模方法

采用公认的WADE法制造脊髓损伤后中枢性疼痛模型，用10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射，麻醉大鼠，将大鼠置于俯卧位，在背部正线L1脊髓节段处沿上下各1.5cm逐层切开皮肤，在胸12-腰3之间将双侧椎旁肌肉钝性分离，咬除胸13-腰2棘突，暴露腰1节段脊髓，应用脊髓损伤仪将重20g、尖端直径2mm的铜棍从15cm处坠落至脊髓，造成脊髓损伤，假手术组不造成脊髓损伤。手术伤口局部使用少许青霉素粉消炎抗菌，逐层缝合伤口。术后苏醒后，放回笼中观察。术后3天每日用碘伏擦拭伤口1次消炎抗菌。对SCI大鼠，人工挤压排尿每日3次，3日后改为每日2次，直至自主排尿。

1.3 动物分组及处理

利用随机数字表法将40只大鼠随机分为4组：正常组、模型组、假手术组、电针组，每组10只。

①正常组（Normal group）：正常饲养7天。

② 模型组（Model group）：建立脊髓损伤大鼠模型，造模后正常饲养7天。

③假手术组（Sham group）：所有手术步骤同模型组，暴露腰1脊髓节段后不损伤脊髓，造模后正常饲养7天。

④电针组（Electro-acupuncture group，EA group）：模型建立后，每天电针双侧腰1“夹脊穴”、“委中”，每次20min，连续治疗7天。

正常组、模型组和假手术组在治疗期间，每天抓取一次，不做其他特殊处理。所有大鼠存活期满7天后，麻醉处死。

1.4 腧穴的选择及电针操作

选取双侧腰1“夹脊穴”（Ex-B2）、“委中”（BL 40），按照《实验针灸学》[4]所附的常用实验动物针灸穴位取穴。

“腰1夹脊穴”深度5㎜，“委中”深度3㎜。将同侧腰1“夹脊穴”和“委中””穴相连，连接韩式穴位神经刺激仪（6805-D型，汕头市医用设备厂有限公司生产），频率2/100 Hz，强度1～3mA（以动物肢体微颤为度），持续20 min，每天1次，连续治疗7 d。

1.5 指标检测

1.5.1  行为学观察

各组均在上午9：00～11：00进行行为学检测，各组行为学检测均在上午9：00～11：00进行，且由不了解实验目的、意义和实验分组情况的固定人员进行。每日对大鼠自发痛行为学的变化（舔咬、搔抓损伤水平以下部位如后部躯干、后足、尾部等）观察2次。

1.5.2  热刺激爪退缩阈值（Thermal withdrawal latency， TWL）

测量大鼠热刺激爪退缩阈值的方法，在大鼠清醒状态下，采用热刺痛仪，测定术前1 天，术后3、5、7天的TWL。由以下公式计算：TWL变化百分率：TWL改变百分率（%）=（即刻痛阈-基础通阈）/基础痛阈×100。

1.5.3  机械缩爪阈值（Mechanical withdrawal threshold， MWT）

在大鼠清醒状态下，采用爪触痛仪测定术前1天，术后3、5、7天的机械缩爪阈值。由以下公式计算：MWT变化百分率：MWT改变百分率（%）=（即刻痛阈-基础通阈）/基础痛阈×100。

1.5.4  逆转录聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）检测P2X4和IL-1β的含量

Trizol法抽提组织总mRNA，逆转录、实时荧光定量PCR反应根据试剂盒说明书操作。引物序列分别为：P2X4上游引物：5`-AACATCCTCCCCAACATC-3`，下游引物：5`-CTCAACTGCCAT CTCCTG -3`，IL-1β： 上游引物 5`-CTCCATGAGCTTTGTACAAGG-3`， 下游引物5`-TGCTGAT GTACCAGTTGGGG-3`;β-actin： 上游引物5`-TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGTAAAG-3`， 下游引5`-CGTAGAAGCATTTGCGGTGCA CGATGGAGG-3`。PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃ 30s，59℃ 30s，72℃ 30s，32次反复循环扩增，最后72℃延伸10min。以β-actin为内参照，以1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，用凝胶成像分析系统，对PT-PCR产物电泳条带进行吸光度（A）值分析。

1.6统计方法

实验数据应用Spss 20.0统计学软件进行分析，所有实验数据均用平均值±标准差（）表示。各组热刺激爪退缩阈值在不同时间点的比较采用双因素方差分析（two-way ANOVA），组间比较采用Turkey法。RT-PCR检测中P2X4和IL-1β的含量则采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计，组间比较采用LSD法。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 行为学测定

实验期间，各组大鼠正常，在活动时未表现出任何的运动障碍，在站立休息时也未表现出喜欢用某一侧肢体来承重的现象，没有出现大小便失禁的现象，没有烦躁、撕咬肢体、频繁的摇动尾巴、食欲降低等表现。

2.2 热刺激爪缩退阈值变化率

与正常组比较，假手术组各时间点TWL差异没有统计学意义（P>0.05），模型组术后3、5、7 d其TWL均降低，有显著差异（P<0.05），模型组TWL持续降低至术后7 d。与模型组相比，假手术组术后3、5、7 d的TWL均有显著差异（P<0.05）。术后3 d电针组TWL与正常组比较有显著差异（P<0.05），术后5、7 d与模型组比，电针治疗组TWL升高，有显著差异（P<0.05）。

2.3机械缩爪阈值（ mechanical withdrawal threshold， MWT）变化率

与正常组比较，模型组术后3、5、7天MWT下降，有显著差异（P<0.05），假手术组没有显著差异（P>0.05）。与模型组比较，假手术组术后3、5、7天的MWT有显著差异（P<0.05），电针组术后3 天 MWT与正常组比较有显著差异（P<0.05），术后5、7天与模型组比MWT上升，有显著差异（P<0.05）。

2.4脊髓水平P2X4 mRNA表达变化

与正常组相比，模型组P2X4 mRNA表达明显上升（P<0.05）。假手术组中的P2X4 mRNA表达与正常组之间未见统计学差异（P>0.05）。假手术组与模型组之间有显著差异（P<0.05）。电针组与模型组比较，P2X4 mRNA表达下降，其差异有统计学意义（P<0.05）。

2.5脊髓水平IL-1β mRNA表达变化

与正常组相比，模型组IL-1β mRNA表达明显上升（P<0.05）。假手术组与正常组之间之间的差异没有统计学意义（P>0.05）。假手术组与模型组之间有显著差异（P<0.05）。电针组与模型组比较，IL-1βmRNA表达明显下降（P<0.05）。结果见表4。

3讨论

与临床其他治疗方法相比，针刺治疗神经病理性疼痛疗效显著、安全性高、生理干扰小、副作用小，具有其显著的优越性。针刺效应主要是通过刺激腧穴来调整脏腑、调节气血和疏通经脉，从而发挥针刺镇痛作用。夹脊穴电针能抑制前炎性细胞因子的表达，减轻过度的炎症反应对脊髓组织造成的继发性损伤[5]。

小胶质细胞是中樞神经系统的“巨噬细胞”[6]。正常情况下，小胶质细胞处于静息状态，表面有少量受体的表达，主要包括趋化因子受体、P2X受体（P2X receptors，P2XRS）和Toll样受体（toll like receptors，TLRS）。脊髓损伤后受体表达上调，作用于其下游信号，促进脊髓小胶质细胞的激活。而活化的小胶质细胞表面表达的 P2X4受体可以诱导神经病理性疼痛[7]。同时活化的小胶质细胞可释放大量的细胞因子、炎症介质和神经活性物质，如白介素-1β（IL-1β）[8]、肿瘤坏死因子（TNF-α）、一氧化氮（NO）等，上述物质又能作用于未活化的脊髓小胶质细胞扩大疼痛反应[9]，引起神经炎性反应和神经免疫反应，这可能就是神经损伤产生和维持疼痛的原因[10]。

本研究结果提示电针治疗可以调节热痛阈和刺痛阈，发挥镇痛作用。RT-PCR结果中，脊髓损伤后大鼠脊髓P2X4mRNA及IL-1βmRNA表达明显上升，提示P2X4及IL-1β参与神经病理性疼痛发生过程。针刺治疗后脊髓中P2X4mRNA及IL-1βmRNA表达有明显下降。

综上所述，我们推测针刺通过抑制脊髓小胶质细胞的激活，减少活化小胶质细胞释放的IL-1β等炎性因子，从而减轻脊髓损伤后出现的痛觉过敏。但由于本研究实验样本量小，观察时间点较少，实验结果还有待进一步证实。而且本研究只观察了电针对 P2X4和 IL-1β 的影响，其它细胞因子可能也参与了电针缓解脊髓损伤后中枢性疼痛机制。今后如能再进行大样本、多时间点、多细胞因子的重复性实验，可进一步深入探讨电针治疗神经病理性疼痛的作用机制。

参考文献：

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[10]TSUDA M， INOUE K， SALTER MW. Neuropathic pain and spinal microglia： a big problem from molecules in "small" glia[J].Trends Neurosci， 2005， 28（2）：101-107.

基金项目：十堰市引导性项目（17Y09）

作者简介：冀丽丽，女，1990.02.02，湖北省十堰市，汉，硕士研究生，住院医师，神经康复