非小细胞肺癌患者呼出气冷凝液中microRNA486表达及其应用价值分析

李荔，孙苹苹，陈金亮，陈建荣，陶国华(南通市第一人民医院.检验科，.呼吸科，江苏南通226001)

根据国家癌症中心2015年数据统计显示，肺癌位居我国恶性肿瘤发病首位，占城市和农村恶性肿瘤死亡率第一位[1]。肺癌根据病理类型可分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)两大类，肺癌中80%～85%是NSCLC[2-3]。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一类非编码小分子RNA，长约18～25个核苷酸，转录后通过识别靶miRNA 3′端非翻译区(3′UTR)并与之互补结合，抑制miRNA的翻译过程或促进靶miRNA的降解，发挥调控基因表达的作用[4]。研究表明，miRNA与多种肿瘤的发生密切相关，它可作用于抑癌基因的靶点，使其表达下调，促进肿瘤形成；也可作用于癌基因，阻止细胞的恶性转化[5-7]。microRNA486(miR-486)属于抑癌基因，与肺癌的发生、预后相关[8-10]。

呼出气冷凝液(exhaled breath condensates，EBC)是一种生物液体，是呼吸道的天然基质，DNA、RNA、蛋白质、代谢物和挥发性化合物均可存在于EBC中。它是一种非侵入性采集的标本，正逐渐受到重视。目前，对于肿瘤组织和血液中miRNA的研究报道较多，而EBC中肺癌标志物的相关研究较少[11]。本研究旨在通过分析50例经组织病理学证实的NSCLC患者EBC中miR-486的相对表达水平，并评价其在NSCLC中的临床应用价值。

1 对象与方法

1.1研究对象 选取2016年6月至2017年12月在我院呼吸科和胸外科接受治疗并经组织病理学证实为NSCLC的50例患者为研究对象，男27例，女23例，年龄42～83岁，中位年龄68.5岁。上述患者中鳞癌16例，腺癌34例，手术前均未接受放、化疗及免疫治疗、靶向治疗。肺癌的临床分期参考国际抗癌联盟(UICC)2017年版NSCLC分期标准，Ⅰ期4例，Ⅱ期17例，Ⅲ期18例，Ⅳ期11例。纳入同期本院体检健康者50例作为对照组，其中男28例，女22例，年龄34～78岁，中位年龄48岁。肺癌组和对照组年龄、性别及吸烟史差异均无统计学意义(P均>0.05)。本研究经我院医学伦理学委员会批准(批准文号：2017KY139)，研究对象均签署知情同意书。

1.2仪器和试剂 StepOne Plus荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，OneDrop 1000+微量分光光度计(日本松下电器公司)，EcoScreen冷凝器和Master Screen简易冷凝器(EricJaeger公司)，602全自动化学发光分析仪(德国Roche公司)。miRNA提取分离试剂盒(批号R6529)、增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒(批号R6519)、增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(批号R6510)均购于北京天根公司。癌胚抗原(CEA，批号28657403)、细胞角蛋白19片段(CYFRA211，批号21374203)化学发光检测试剂盒均购自德国Roche公司。

1.3方法

1.3.1标本采集与处理 NSCLC患者于入院第1天采集外周血标本。体检健康者在体检期间采集外周血标本。用含促凝胶真空采血管采集研究对象静脉血标本5 mL，1 000×g离心10 min，分离血清样品(≥500 μL)，用无RNase离心管分离后于-70 ℃保存备用。用EcoScreen冷凝器或者Master Screen简易冷凝器预冷15 min，嘱研究对象漱口、戴鼻夹，经咬嘴平静呼吸20 min后取出收集管，待标本液化后可得到2～4 mL液体，即EBC；随即放入无RNase离心管中，于-70 ℃保存备用。留取肺癌患者手术后的癌组织，经液氮快速冷冻后-70 ℃保存备用。

1.3.2总RNA的提取 采用miRNA提取分离试剂盒提取组织、血液和EBC标本RNA。

1.3.3RNA含量和纯度测定 按照OneDrop 1000+微量分光光度计操作手册，对提取的RNA测定浓度及纯度。评价RNA样品纯度，取A260 nm/A280 nm控制在1.8～2.1的样品用于后续实验。

1.3.4参照基因的选择 本研究选择在组织细胞中稳定表达且应用最多的U6作为NSCLC患者组织中的参照基因。但由于目前U6等内参基因在体液中的稳定性尚存在争议，因此本研究选取cel-miR-39作为血清和EBC中目的基因检测时的参照基因。

1.3.5引物设计 用Primer Premier 5.0软件设计引物，miR-486、U6、cel-miR-39引物序列见表1，由北京天根公司合成。

表1 miR-486和参照基因引物序列

1.3.6反应体系和条件 cDNA第一链合成：2×miRNA RT Reaction Buffer 10 μL，miRNA RT Enzyme Mix 2 μL，RNase-Free ddH2O补至20 μL，42 ℃ 60 min，95 ℃ 3 min；PCR体系：cDNA 2 μL，miRNA荧光定量检测试剂10 μL，引物终浓度200 mmol/L，反应体积为20 μL。反应条件：94 ℃，2 min；94 ℃，20 s；64 ℃，34 s，40个循环。

1.3.7CEA、CYFRA211的检测 按试剂盒说明书采用化学发光法检测CEA、CYFRA211。CEA参考区间：<5 μg/L。CYFRA211参考区间：<3.5 μg/L。

1.4统计学分析 用SPSS 21.0统计软件进行。qRT-PCR数据采用2-ΔΔCt法处理后再进行统计学分析。计量资料先做正态性检验(K-S检验)；若数据符合正态分布，两组数值比较采用t检验；若不符合正态分布，采用两独立样本的非参数检验(Mann-WhitneyU检验)。两组计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。对NSCLC的诊断价值用ROC曲线分析。

2 结果

2.1血清miR-486、CEA、CYFRA211水平 见表2。K-S检验结果显示，各组miR-486、CEA、CYFRA211数据呈非正态分布(P<0.05)。Mann-WhitneyU检验结果显示，与健康人对照组比较，NSCLC组血清miR-486表达水平降低(P<0.01)，而CEA、CYFRA211水平升高(P<0.01)，差异均有统计学意义。

表2健康人对照组和NSCLC组血清miR-486、CEA、CYFRA211水平比较[M(P25，P75)]

分组nmiR-486CEA(μg/L)CYFRA211(μg/L)健康人对照组501.8(0.92,4.31)2.33(0.5,4.7)1.62(0.2,3.4)NSCLC组500.73(0.21,1.92)12.5(5.1,20.2)6.7(3.3,11.4)Z(P)值-3.058(<0.01)-8.593(<0.01)-10.058(<0.01)

2.2组织、血清和EBC中miR-486的表达水平 肺癌组织中miR-486的相对表达水平0.58(0.32,1.17)低于癌旁组织1.66(0.82,3.21)，差异有统计学意义(Z=-3.20，P<0.05)。肺癌组血清中miR-486的相对表达水平0.73(0.21,1.92)低于健康人对照组1.78(0.92,4.31)，差异有统计学意义(Z=-4.68，P<0.05)。肺癌组EBC中miR-486的相对表达水平0.50(0.32,1.02)低于健康人对照组1.56(0.81,3.02)，差异有统计学意义(Z=-3.94，P<0.05)。

2.3不同TNM分期miR-486表达水平 不同TNM分期NSCLC患者组织、血清和EBC中miR-486相对表达水平见表3。Ⅲ～Ⅳ期患者组织、血清和EBC中miR-486相对表达水平均低于Ⅰ～Ⅱ期患者，差异均有统计学意义(P均<0.05)。

表3 不同TNM分期miR-486相对表达水平

2.4不同病理类型miR-486相对表达水平 不同病理类型NSCLC患者组织、血清和EBC中miR-486相对表达水平见表4。鳞癌患者组织、血清和EBC中miR-486相对表达水平与腺癌患者比较差异无统计学意义(P均>0.05)。

表4 miR-486在不同病理类型中相对表达水平

2.5miR-486诊断NSCLC的价值 组织中miR-486的ROC曲线下面积(AUCROC)为0.783，当cut-off值取0.94时，敏感性为87%，特异性为70%。血清中miR-486的AUCROC为0.752，当cut-off值取0.615时，敏感性为74%，特异性为72%。EBC中miR-486的AUCROC为0.792，当cut-off值取1.08时，敏感性和特异性分别为92%和52%，miR-486与血清CEA、CYFRA211联合筛查NSCLC时AUCROC为0.776，当cut-off值取0.68时，敏感性和特异性分别为72%和78%。

3 讨论

miR-486是一类在哺乳动物中高度保守的miRNA，位于染色体8p11，是许多癌症中基因组丢失的一个区域。本研究结果显示，miR-486在NSCLC患者癌组织、血清及EBC中均呈低表达状态。miR-486相对表达水平与NSCLC患者TNM分期有关，可能成为预测NSCLC患者预后的指标，与毕雪冰等[12]研究结果一致。本研究中组织、血清和EBC miR-486的表达水平与病理细胞类型均无关，分析原因可能与样本量少有关，需扩大样本量作进一步研究。ROC曲线分析显示，EBC中miR-486的检测对于NSCLC患者敏感性较高，但是特异性不如组织和血清。EBC中miR-486和CEA、CYFRA211联合应用时，AUCROC为0.776，当cut-off值取0.68时，敏感性和特异性分别为72%和78%，与文献[13]报道一致。本研究认为，虽然EBC采集是一种无创、安全的技术，可以在整个随访过程中反复采集样本而不会给患者带来不适。但由于本研究样本量较小，还需要进行大规模多中心临床研究来验证其有效性。