活体染色法在筛查尿液诱饵细胞中的应用

闫立志，张时民(.内蒙古包钢医院医学检验科，包头0400；.北京协和医院检验科，北京0003)

诱饵细胞(decoy cells)是肾小管上皮细胞或尿路上皮细胞感染多瘤病毒(Plyoma viru，PV)后出现特征性变化的细胞。该类细胞胞核明显增大，可见核内包涵体，胞核呈毛玻璃样改变，容易被误认为是肿瘤细胞，所以称为“诱饵细胞”[1]。 肾移植术后长期服用免疫抑制剂增加了PV感染的风险，当感染PV后可以引起移植肾功能损伤，导致PV相关性肾病(Polyomavirus-associated nephropathy,PVAN)[2-3]。在机体内PV也可以处于潜伏状态，当机体免疫力低下时迅速激活和复制，导致移植肾功能急剧下降甚至丧失[3,4-7]。 因此，检测PV是预防PVAN的关键。人PV有10余种，其中最常见的是BK 病毒(BK virus，BKV)和JC病毒(JC virus,JCV)[8]。检测PV的方法有很多，而检测尿液中诱饵细胞是一种有价值且无创的筛选PVAN的方法[9]。诱饵细胞可以通过多种染色法检出，活体染色法就是其中一种，沙黄-结晶紫(Sternheimer-Malbin，SM)染色法与阿利新蓝-派洛宁(Sternheimer，S)染色法都是活体染色法，染色原理相同，可以使细胞快速着色，染色后的细胞结构清晰，与背景色对比鲜明[10]。本研究收集大量病例，观察SM染色法与S染色法2种活体染色法在尿液诱饵细胞检测方面的性能。

1 材料和方法

1.1标本及来源 收集2019年1月至2020年4月内蒙古包钢医院106例肾移植患者尿液标本，其中男74例，女32例，年龄17～65岁，患者均服用免疫抑制剂3个月以上。用洁净的一次性尿沉渣管收集患者2份清洁中段尿液标本各10 mL，其中一份用于镜检筛查诱饵细胞，另一份标本在镜检诱饵细胞阳性时用于PV核酸检测。

1.2仪器与试剂 ABI7500 PCR扩增仪(美国ABI公司)，Olympus BX43显微镜(日本奥林巴斯公司)，BKV、JCV核酸检测试剂盒(北京鑫诺美迪公司)，SM染色液、S染色液(珠海BASO公司)。

1.3标本处理及染色 将留取的10 mL尿液标本以1 500 r/min离心5 min，弃去上清液，留0.2 mL尿沉渣，将尿沉渣充分混匀，取20 μL标本滴加到载玻片，盖一张盖玻片，用普通光学显微镜检查诱饵细胞。将剩余尿沉渣分成2管，按照标本与染色液10∶1的比例，分别加入SM染色液和S染色液，用一次性吸管在管底轻轻混匀，染色时间1 min，取20 μL染色后标本加至清洁载玻片上，盖一张盖玻片，用普通光学显微镜检查诱饵细胞，并用数码照相设备拍摄图片。

1.4BKV、JCV核酸检测 对发现诱饵细胞的尿液标本进行BKV、JCV核酸检测。将标本颠倒混匀，振荡15 s，取1 mL移至1.5 mL EP管中，13 000 r/min离心10 min后弃去上清液，加入50 μL裂解液，然后用吸头将沉淀挑起，吹吸5次，提取核酸，再进行PCR反应。反应条件：UDG酶反应，37 ℃，2 min；预变性，95 ℃，3 min；变性，94 ℃，15 s；退火、延伸、荧光信号采集，60 ℃，35 s，循环40次；仪器冷却，25 ℃，1 min。结果分析：反应结束后，根据PCR仪说明书及荧光曲线调整基线和阈值，基线的起始点设定在5～8之间，终止点设定在12～15之间，阈值线通常设定在1 000～5 000之间，分析各标本的Ct值和相应的初始浓度。

2 结果

2.1SM染色法镜检诱饵细胞的形态学特征 诱饵细胞体积明显增大，胞体大小不一，形状不规则，SM染色后胞质为蓝紫色，胞核紫红色；胞质量多少不一，呈粗颗粒状，胞核大，明显偏位，核膜增厚，核质比偏高；核染色质结构破坏，呈粗颗粒或块状，胞核呈空泡样改变，部分细胞可见核内病毒包涵体，少量细胞胞核脱出，仅见裸核。肾小管上皮细胞感染PV形成的诱饵细胞见图1A～D，正常的肾小管上皮细胞见图1E，未染色诱饵细胞见图1F。

注：A，诱饵细胞体积大小不等，胞质呈蓝紫色，胞核呈紫红色，可见包涵体颗粒；B，箭头所指为诱饵细胞，胞体增大，胞核呈空泡样改变，核膜明显增厚；C，箭头所指为诱饵细胞，胞体不完整，胞核明显增大，可见核内包涵体；D，双核诱饵细胞，胞体增大，胞核呈气球样；E，正常肾小管上皮细胞，胞体不规则，体积偏小，胞质紫红色，胞核深红色，呈颗粒状；F，未染色诱饵细胞。

2.2S染色法镜检筛查诱饵细胞的形态学特征 诱饵细胞形态学特征同尿沉渣SM染色，胞质和胞核着色略有不同，尿沉渣S染色后胞质为紫红色，胞核深蓝色，包涵体颗粒呈深蓝色。S染色后的细胞结构更加清晰，颜色对比明显。肾小管上皮细胞感染PV形成的诱饵细胞见图2A～D，尿路上皮细胞感染PV发生形态学变化，见图2E，正常的肾小管上皮细胞见图2F。

注：A，诱饵细胞胞质呈紫红色，胞核深蓝色；B，诱饵细胞胞核脱出，呈空泡样，可见核内包涵体；C，诱饵细胞核质比明显偏高，核膜增厚，可见核内包涵体；D，诱饵细胞胞体增大，核膜明显增厚；E，尿路上皮细胞感染PV，胞核增大，胞质呈挖空样；F，正常肾小管上皮细胞，体积小，胞质呈紫红色，胞核深蓝色，染色质呈颗粒状。

2.3诱饵细胞检查结果 在106例长期服用免疫抑制剂肾移植患者的尿液标本中，用未染色直接镜检法检出12例诱饵细胞，阳性率11.3%，而使用SM染色法或S染色法检出21例诱饵细胞，阳性率19.8%。对21例尿液镜检出诱饵细胞的标本，检测BKV、JCV核酸共计20例，阳性符合率95.2%，其中BKV核酸阳性6例，占28.6%；JCV核酸阳性10例，占47.6%；BKV和JCV核酸同时阳性4例，占19.0%。

3 讨论

未染色直接镜检法筛查诱饵细胞，细胞结构不清，核内包涵体不易观察，容易漏检。活体染色法最大的优势是染色后的细胞结构清晰，保持细胞原有形态，不会因制片等因素造成细胞形态发生变化，而且操作简单、染色快速，不易漏检。本研究选用SM染色法和S染色法，通过实验发现2种染色法诱饵细胞检出率相同。在实验过程中发现，2种染色法易受尿液pH影响，染色后的细胞胞质与胞核颜色略有差别。在尿液诱饵细胞分类过程中，部分病例中同时伴有吞噬细胞不同程度的增多。此外，部分病例尿路上皮细胞可见典型的“挖空”现象，这些细胞形态的改变，可能与PV感染相关。