长孢洛德酵母菌致腹膜炎1例及生物学特性分析

吴小利，邵玲，翟明贺，刘丽文(辽宁省人民医院检验医学科，沈阳110016)

长孢洛德酵母菌(Lodderomyceselongisporus，L.elongisporus)是以Jacomina Lodder博士名字命名的一种酵母菌，于1952年首次被描述为Saccharomyceselongasporus[1]，曾被认为是念珠菌的一个分枝，但有研究表明其是一个不同的物种[2-3]。系统发育分析中长孢洛德酵母菌与近平滑念珠菌(C.parapsilosis)、白念珠菌(C.albicans)、都柏林念珠菌(C.dubliniensis)和热带念珠菌(C.tropicalis)被划分在一个分枝，是该分枝中唯一产生子囊孢子的物种[4]。2008年首次报道长孢洛德酵母菌引起人类菌血症[5]，目前关于临床感染的报道仍较少。由于该菌分离率低，形态易与其他酵母菌混淆，广泛使用的鉴定方法Vitek 2和API 20C易发生误判而影响抗真菌药物的选择，从而延误患者的治疗，增加患者负担[6]。本研究通过从一位肾病患者透析液中检出1株长孢洛德酵母菌，对该菌的微生物学特征、鉴定及药物敏感性进行分析，以期提高临床对于该菌的认识。

1 材料与方法

1.1菌株来源 菌株分离自2019年辽宁省人民医院1例腹膜透析相关性感染的56岁男性患者。患者诊断依据2010年国际腹膜透析学会指南中关于腹膜透析相关性感染诊断标准[7]。患者入院第2天及第7天2次腹透液经血培养增菌培养均获得相同分离菌。光滑念珠菌ATCC 15126、近平滑念珠菌ATCC 22019、克柔念珠菌ATCC 6258、白念珠菌ATCC 90028均购自上海宝录生物公司，热带念珠菌编号201411菌株为国家卫生健康委临床检验中心质评菌株。

1.2主要试剂与仪器 血琼脂培养基、科玛嘉念珠菌显色培养基(沈阳彦程生物公司)，SDA、PDA培养基(天津金章公司)，革兰染色液(快速)、抗酸染色液(珠海贝索公司)，SensititreTMYeastONE(美国Thermo公司)，真菌基因组DNA提取试剂盒(北京索莱宝公司)；LEICA DM750光学显微镜(德国LEICA公司)，0.45%盐水、Vitek 2 Compact全自动微生物分析系统、真菌鉴定卡(Vitek®2 YST)(法国生物梅里埃公司)，质谱样本处理液、microflexTMLRF质谱分析仪(Bruker Daltonics公司)。引物合成由上海生工生物工程公司完成。

1.3分离菌株的培养与鉴定 将分离菌在血平板、科玛嘉显色平板及PDA平板上35 ℃培养，分别观察24 h、48 h、72 h、96 h菌落形态；取血平板上培养24 h菌落涂片并采用结晶紫染色和革兰染色后观察镜下形态；取血平板上培养24 h菌落置于装有0.5 mL新鲜血清试管中，35 ℃培养2 h，制作湿片镜下观察芽管形成情况，用白念珠菌ATCC 90028作对照；取血平板上培养48 h菌落于0.45%盐水中制备3.0麦氏浊度单位菌悬液，采用Vitek®2 YST卡在Vitek 2 Compact全自动微生物分析系统进行鉴定；同时取血平板上培养48 h单个菌落涂布靶板，自然干燥后加入1 μL 70%甲酸覆盖点样孔，自然风干后，加1 μL质谱样本处理液，自然风干后上基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)仪进行鉴定并依据仪器说明进行结果判读。

1.4基因序列分析 收集血平板上培养48 h菌落，按照真菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取。参照文献[8]合成真菌通用引物，进行PCR扩增，引物为ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGC

GG-3′) 和 ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR反应体系30 μL，包括2×Taq plus mix 15 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 12 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 5 min。行12 g/L琼脂糖凝胶电泳并对目的条带进行回收(主要试剂：溶胶液、磁珠、ddH2O、80%乙醇)，采用Sanger法在ABI 3730XL设备上进行测序，由北京睿博兴公司完成。将测序序列和GenBank数据库进行BLAST比对分析。

1.5聚类分析 建立分离菌长孢洛德酵母菌的数据库，通过MALDI Biotyper 3.1软件与白念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)、近平滑念珠菌5种常见酵母菌及库内已知的3株L.elongisporus进行聚类分析，得出系统树状图。

1.6药物敏感性分析 取SDA平板上培养24 h菌落并制备0.5麦氏浊度单位菌悬液，取20 μL菌悬液加入YeastONE真菌接种肉汤中混匀，真菌药敏板每孔加入混匀后的YeastONE真菌接种肉汤100 μL，密封后于35 ℃培养箱中温育24 h后进行结果判读。

2 结果

2.1长孢洛德酵母菌培养特性、菌落形态 分离菌株在血平板和PDA培养基上培养24～96 h呈白色光滑菌落；在科玛嘉显色平板上培养24 h为白色小菌落，48～96 h逐渐显色，最终呈蓝绿色菌落。见图1。血平板上生长24 h后经芽管生成试验未见芽管形成，革兰染色和结晶紫染色镜下呈现卵圆形孢子。长孢洛德酵母菌在科玛嘉显色平板上呈蓝绿色菌落，颜色介于白念珠菌的淡蓝绿色和暗蓝、蓝灰色的热带假念珠菌之间，与近平滑念珠菌、克柔念珠菌及光滑念珠菌的紫色系列明显不同，见图2。

注：a1～a4，为血平板；b1～b4，为科玛嘉显色平板；c1～c4，为PDA平板。

注：a，长孢洛德酵母菌；b，克柔念珠菌；c，近平滑念珠菌；d，光滑念珠菌；e，白念珠菌；f，热带念珠菌。

2.2Vitek 2和MALDI-TOF MS鉴定结果 Vitek 2鉴定分离菌结果为无名念珠菌(C.famata)，MALDI-TOF MS鉴定分离菌为长孢洛德酵母菌(得分为2.10)。

2.3ITS rRNA基因序列分析结果 PCR扩增产物Sanger法测序长度为565 bp，将序列和GenBank数据库进行BLAST比对，相似性排在前3位的均为L.elongisporus(登录号：JN606251.1、KF959855.1和AY391845.1)，相似性分别为99.47%、99.46%和99.46%。

2.4聚类分析结果 所选6种酵母菌分为2类，其中长孢洛德酵母菌与白念珠菌、热带念珠菌以及近平滑念珠菌在同一分类中，而长孢洛德酵母菌与近平滑念珠菌在同一亚类中，白念珠菌与热带念珠菌在另外一个亚类中。分离菌与质谱数据库中已知3株参考菌株在同一个聚类图分枝中，但不是同一株菌。见图3。

注：*为分离菌。

2.5药敏结果 分离菌株对检测药物的MIC分别为米卡芬净(0.015 μg/mL)、卡泊芬净(0.03 μg/mL)、5-氟胞嘧啶(0.12 μg/mL)、泊沙康唑(0.03 μg/mL)、伏立康唑(0.03 μg/mL)、伊曲康唑(0.12 μg/mL)、阿尼芬净(0.03 μg/mL)、氟康唑(0.5 μg/mL)、两性霉素B(0.25 μg/mL)。

3 讨论

长孢洛德酵母菌在科玛嘉显色培养基上呈现蓝绿色菌落，易与常见菌白念珠菌及热带念珠菌混淆，后二者在显色培养基上分别呈现淡蓝绿色和暗蓝、蓝灰色菌落。其中，长孢洛德酵母菌和白念珠菌的鉴别在无其他辅助设备使用的情况下可通过芽管试验进行区分，光学显微镜下白念珠菌有芽管生长，而长孢洛德酵母菌无芽管生长。应用Vitek或API鉴定时，长孢洛德酵母菌易被误鉴定为近平滑念珠菌[5-6,9-11]，而本研究菌株经Vitek鉴定为无名念珠菌。采用MALDI-TOF MS或测序进一步明确鉴别为长孢洛德酵母菌。但国内很多中、小型微生物实验室，由于MALDI-TOF MS或测序并未得到广泛使用，仅根据科玛嘉显色培养基上的菌落颜色及Vitek表型鉴定结果，会造成对长孢洛德酵母菌的漏诊及误诊。本研究通过MALDI Biotyper 3.1软件对分离菌增建菌株库，与5种酵母菌(包括白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、东方伊萨酵母)参考菌株进行聚类分析，发现长孢洛德酵母菌与白念珠菌、热带念珠菌以及近平滑念珠菌在同一分枝中，这与Diezmann等[12]的发现相一致。通过MSP树状图增建菌株库可提高实验室的检测能力。

据文献报道，长孢洛德酵母菌可引起人类血流感染[5,13]、导管相关血流感染[9,11]以及心内膜炎[10]。本研究中患者3年前诊断为多发性骨髓瘤，经数次化疗，长期激素、免疫抑制剂及广谱抗菌药物治疗导致患者免疫功能降低，机体处于免疫抑制及菌群失调状态，进而造成真菌侵袭性感染的机会增加。该菌易感因素尚不明确，可能与恶性肿瘤、免疫抑制剂的长期使用、留置导管等有关。目前，国际上关于长孢洛德酵母菌的治疗尚无统一方案，药敏试验方法也无统一标准及药敏折点判读标准。检索报道的7例病例中4例死亡、3例治愈的患者虽治疗方案不同，但均使用了棘白菌素类药物[13]。但由于技术手段的局限性而错误将长孢洛德酵母菌鉴定为近平滑念珠菌时，因棘白菌素类药物对近平滑念珠菌作用较弱，可能会造成临床诊断及治疗的延误，从而给患者带来经济负担及增加死亡率。由于现有鉴定技术可能存在的不足，临床感染长孢洛德酵母菌的检出率被低估。因此，提高微生物实验室对该菌的识别能力和临床对该菌感染的重视度十分重要。