重组人溶菌酶对口腔常见致病菌抑菌活性的研究*

庞恋苏 匡慧慧 孙 佟 胡 巍 张凤成 李亚男

口腔的常见疾病如龋病、牙周病、口腔黏膜疾病等均与病菌感染相关，多数学者认为口腔内优势菌的出现是诱发这些疾病发生发展的主要原因。溶菌酶(Lysozyme，LYZ)[1]具有抗菌、抗病毒、消炎、增强免疫力等特性，临床已经用溶菌酶来治疗上呼吸道感染、咽喉炎等感染性疾病，但其仍具有异源性、生物活性低、性质不稳定、不耐酸、易产生抗原性等缺点。现商品化溶菌酶多为蛋清溶菌酶，即由鸡蛋蛋清中提取的溶菌酶(Hen egg-White Lysozyme，HEWL)。重组人溶菌酶(Recombinant Human Lysozyme，RHLYZ)来源于人体自身，对人体本身不会产生任何免疫排斥反应，也不具有耐药性，无毒副作用[2]。目前对重组人溶菌酶对口腔的常见致病菌的抑菌作用研究较少，本实验旨在研究重组人溶菌酶对口腔常见致病菌的抑菌作用，为后续治疗口腔感染的新型制剂的研发提供研究基础。

1.实验材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌群 变形链球菌S.mutans UA159(四川大学口腔生物医学工程重点实验室)、白色念珠菌ATCC90029(四川大学口腔生物医学工程重点实验室)、牙龈卟啉单胞菌(ATCC33277)(四川大学口腔生物医学工程重点实验室)、临床分离菌株(Sm、Ca、Pg)。

1.1.2 培养基 牛心脑浸液培养基(BHI)、科马嘉(CHROMagar)念珠菌显色培养基、一次性沙保罗琼脂培养基(Sabouraud dextrose agar,SAD)、RPMI Medium1640(Gibco)、M-H 琼脂培养皿、哥伦比亚血平板、Hemin-Vitc 液、羊血(均购自青岛海博生物科技有限公司，中国)。

1.1.3 主要仪器和设备 厌氧产气袋、密封袋(松隆株式会社，日本)、752N 型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器，中国)、电子天平、PH仪(贝克曼公司、美国)、恒温金属仪、DHZ-DA大容量全温振荡器、细菌微量生化鉴定管、菌板(梅里埃公司，法国)、显微镜(奥林巴斯公司，日本)、革兰染色试剂盒(上海生科生物科技有限公司，中国)、96 孔板(康宁公司，美国)等。

1.1.4 重组人溶菌酶(Recombinant Human Lysozyme，RHLYZ)(广州奇龙生物医药，中国)、溶菌酶(Lysozyme，LYZ)标准品(北京索莱宝科技公司，中国)，0.9%无菌生理盐水(四川科伦药业股份有限公司，中国)。

1.2 临床菌株分离培养

1.2.1 纳入标准 所选患者来自于2016 年7 月至2018 年10 月期间就诊于解放军总医院、解放军总医院海南医院口腔科的患者共52 名，年龄为30～75 岁，进行试验患者均签署知情同意书，实验均通过伦理学审查。

①选取牙体组织缺损达1/3-2/3、表面发黑、探诊质软，上有软龋覆盖的患者。

②戴用可摘义齿6 个月～5 年的患者，诊断为义齿性口炎患者，表现为与义齿接触的腭、龈黏膜发红、水肿，近义齿附近或在义齿承重区黏膜表面溃烂，触诊质软，或有黄白色斑点状假膜；实验室真菌培养为阳性(大于100CFU/ml)。

③选取慢性牙周炎的患者，临床表现为牙齿松动Ⅰ°，BI 指数为3，附着丧失为1～2mm，牙周袋深度为≥4mm。

1.2.2 标本采集 ①用拭子沾取龋坏表面的软龋组织及深部牙体组织，置于缓冲液中。

②用清水漱口后，用浸湿生理盐水的灭菌棉签擦拭对应的黏膜，将获取的样本浸入培养液中。

③用无菌吸潮纸尖在牙周炎患者牙周袋内蘸取龈沟液后置于缓冲液中。

1.3 菌株培养和菌液制备 经实验室和镜下检查确定为目标菌株后，观察培养基上菌落的生长情况，挑选典型菌落4～5 个，接种于BHI-S 培养平板内，37℃厌氧(80%N2、10%CO2、10%H2)环境下复苏48 小时，取出培养好的细菌在3000rpm4℃条件下离心10 分钟，弃去上清液，按麦氏比浊法将细菌的浓度调至1×103cfu/ml，备用。

1.4 实验前期制备 实验分为三组：阳性药物组，实验药物组，空白对照组。

用无菌生理盐水配成每1L 含重组人溶菌酶0.25g、0.5g、1g、1.5g、2g、3g 的RHLYZ 液，浓度分别为0.25g/L、0.5g/L、1g/L、1.5g/L、2g/L、3g/L。阳性对照药物组为HEWL 液，同理配置同样浓度。无菌生理盐水为空白对照组。

1.5 抑菌药物敏感实验

1.5.1 定性试验 ①参照全国临床检验操作规程第三版[3]中的抗细菌药物敏感性试验中的方法进行药敏试验：挑取大约5 个菌落至5ml 生理盐水中，旋摇成均匀的菌悬液后，制备成0.5 号麦氏管浊度，在菌悬液中浸湿无菌棉签，在试管内壁液上方通过旋转棉签挤出多余的菌液。用棉签的侧面从3 个不同的方向密涂在含有5%～10%无菌脱纤维羊血、维生素K1 的哥伦比亚血平板上。白色念珠菌用沙保罗琼脂培养基。均匀涂布菌液。②将灭菌干燥后的6mm 滤纸片放入培养皿，每个菌板放3，分别滴加不同质量浓度的RHLYZ 液、HEWL 液、无菌生理盐水，每个纸片滴加10μL，各纸片间距离均匀相等。③37℃孵育，观察18～24 小时，厌氧菌置于37℃厌氧(80%N2、10%CO2、10%H2)培养，若未见生长者应培养24～48 小时，观察和记录抑菌环直径，用卡尺记录直径，判定抑菌活性。④分别设置两组药物不同的6 种药物浓度，每组药物浓度重复10 次。⑤抑菌环直径大小用表示。

1.5.2 定量试验 ①采用M27-A2 方案[4]中的操作步骤：将RHLYZ 与无菌生理盐水混匀得到浓度为2g/L 的药物溶液。取无菌的96 孔板，第一孔加入200uL 菌液作为阳性对照组，第二孔加入200uL 药液，3 至11 孔分别加入100uL MH 肉汤培养基，从第二孔吸取100uL 加入第三孔，混匀，再吸取100uL 加入第四孔，混匀，以此类推，第十一孔吸取100uL 弃去，此时各孔药物浓度从第二孔至第十一孔依次为2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078125、0.00390625g/L，第十二孔加入200uL 培养基作为空白对照组，然后在2 至11 孔分别加入100uL 的菌液。将接种好的96 孔板放置37℃培养箱种进行培养，24H 观察菌液生长情况，同时用标准菌株做质控。采用酶标仪以空白液体培养基调零测各孔光密度值(OD450)。

MIC 判定：待测孔与阳性对照孔OD450 值有显著差异(P＜0.05)的最低质量浓度为MIC。

MBC 判定：取“MIC 判定”中未见浑浊的高质量浓度孔前后2 孔，吸出培养液，涂布普通琼脂平板，37℃培养18～24 小时后计数菌落，＜5cfu/平板的培养孔质量浓度即为MBC。

②同理测定阳性药物组HEWL 的MIC、MBC。

1.6 统计方法 采用SPSS22.0 统计软件中One-Way ANOVA 对数据进行统计分析，P＜0.05即认为有统计学差异。

2.结果

2.1 K-B 法测定抑菌环直径大小 由表1、表2 可见，对于口腔三种常见致病菌，RHLYZ 组均比HEWL 组产生的抑菌环直径大，差异具有统计学意义。

随着药物浓度逐渐增加，抑菌环大小相对应出现增加，两两对比发现，在变形链球菌组和牙龈卟啉单胞菌组1.5g 和3g 为有效药物浓度，差异有统计学意义。白色念珠菌组，随着药物浓度增加，抑菌环大小差异均有意义。说白色念珠菌对RHLYZ和HEWL 敏感，并且与药物浓度成正相关。

2.2 稀释法测定MIC 和MBC 表3 看出，RHLYZ 组在对抗白色念珠菌时，0.03125g/L 极低质量浓度即对其有抑制作用，0.125g/L 即有杀灭作用，RHLYZ 对变形链球菌在0.125g/L 的浓度时即可对它们产生生长抑制作用，而在对抗变形链球菌时也小于HEWL 组，综合实验可以看到RHLYZ 组的MIC 和MBC 也都小于HEWL，说明重组人溶菌酶的抑菌活性强于蛋清溶菌酶组。两组药物对以上三种微生物均有抑制作用，其中白色念珠菌抑制作用最佳，牙龈卟啉单胞菌次之，变形链球菌最差。

表1 重组人溶菌酶抑菌环直径测量结果() mm

表1 重组人溶菌酶抑菌环直径测量结果() mm

*代表两不同组对比有统计学意义，**代表同组两两对比有统计学意义，P＜0.05。

表2 蛋清溶菌酶抑菌环直径测量结果() mm

表2 蛋清溶菌酶抑菌环直径测量结果() mm

*代表两不同组对比有统计学意义，**代表同组两两对比有统计学意义，P＜0.05。

表3 药物对三种菌作用的MIC和MBC g/L

3.讨论

龋齿是人类的常见病和多发病，我国龋齿的发病率为35%～45%，儿童和老人约可达70%[5]。变形链球菌被认为是龋病的主要致病菌，它通过与口腔唾液相互黏附于牙面，利用食物中的蔗糖产生胞外多糖，分解产酸使牙齿pH 下降，在酸环境中生长繁殖，变形链球菌具有较强的耐酸能力，使釉质再矿化受阻碍从而产生龋损。牙龈卟啉单胞菌是目前公认的牙周炎主要优势菌，属于革兰氏阴性菌，在慢性牙周炎的检出率约为28%～97.4%[6]。义齿性口炎是老年人最常见的口腔黏膜疾病，且发病率随年龄增长显著提高，在义齿及牙列缺失患者粘膜表面多发现白色念珠菌，现也多认为义齿性口炎是白色念珠菌感染引起。口腔中存在700 多种微生物，往往疾病的发生不是一种细菌作用的结果，现也多认为菌群失调是导致疾病发生发展的主要原因，但如何抑制优势菌的生长，达到菌群微生态平衡需要进一步研究。

溶菌酶广泛存在于人体液中，是人唾液中的重要抗菌成分，它能选择性的分解微生物的细胞壁达到抑制细菌的作用。在本实验中，重组人溶菌酶组优于蛋清溶菌酶组原因可能有以下：①重组人溶菌酶主要从动物反应器中提取，蛋清溶菌酶为商品化制剂，导致两者酶作用环境不同，乳汁中含有丰富的乳铁蛋白和抗菌物质，重组人溶菌酶含有非特异性免疫因子，故发挥抗菌作用强于溶菌酶。②两者分子结构存在差异，重组人溶菌酶在pH=5 的条件下能够最大限度的溶解几丁质[7]，也能够使其β-1,4 糖苷键断裂从外部直接溶解细胞壁，使细菌裂解死亡，而溶菌酶的稳定性仅为重组人溶菌酶的1/3，无法有效的保持抑菌活性。③蛋清溶菌酶作为一种外源蛋白，具有免疫原性和毒副作用[8]，这些重组人溶菌酶均不具有。

国内外研究以人溶菌酶活性作为标准对其他溶菌酶进行鉴定发现，奶牛溶菌酶活性为1/300，猪为1/3000，最接近的为鸡，活性是人溶菌酶的1/3[9]。人溶菌酶优于自然界中溶菌酶，但一直以来因为生长周期漫长、产量低、风险高、资金回报率低等各种因素导致出现价格高昂、商品化困难、无法大批量化生产等问题，使重组人溶菌酶无法直接应用于临床。鸡蛋来源的溶菌酶已经在临床上广泛应用，虽然两者具有相似性，但来源不同和结构不同还是使得鸡蛋溶菌酶在很多方面逊色于人溶菌酶，并没有将溶菌酶的优势彻底发挥，综合多数研究可以发现鸡蛋溶菌酶抑菌谱差于人溶菌酶。另外，人溶菌酶还有多种其特有的免疫原性，能够协同抗病毒、抗肿瘤、抑菌等。

2005 年世界卫生组织的统计资料显示，感染性疾病仍是死亡原因头三号杀手[10]。抗菌药物在长期使用中已经具有耐药性，并且刺激性大、毒性高，口腔抗菌药物还存在局部药物浓度过高、易使黏膜、牙面着色等问题。因此，寻找一种使用安全、能有效调理口腔菌群平衡的药物成为治疗疾病的重点。通过生物工程的方法生产的重组人溶菌酶，不会产生任何耐药性以及不良反应，生物活性也较蛋清溶菌酶得到显著提高，在疾病防治领域展现出令人瞩目的前景。