奥拉西坦对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用

关园，关悦，曾令达，徐芳，李铁成*

(锦州医科大学：1附属第三医院麻醉科，3解剖教研室，辽宁 锦州121000；2锦州市中心医院心血管内科，辽宁 锦州121000)

心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion，MI/RI)是一个复杂的病理生理过程，其中涉及到多种信号通路和多种氧化应激反应[1]。近些年实验研究证实，MI/RI的发生机制与氧化应激反应、炎症反应和能量代谢障碍均有密切关系，且细胞凋亡在MI/RI的整个过程中一直存在[2]。奥拉西坦(oxiracetam)是一种环状羟基-氨基丁酸衍生物，与吡拉西坦类似，可作为认知增强剂改善中枢神经系统疾病[3]。奥拉西坦进入机体内可迅速被分解，其产物能促进组织合成大量的磷酰乙醇胺和磷酰胆碱，进而抑制磷脂分解，维持线粒体稳定[4]。有研究表明，奥拉西坦还可以增强乙酰胆碱的释放和转运、加强活性氧自由基清除[5]、抑制氧化应激反应及细胞凋亡[6]。奥拉西坦的药理特性决定其可以对抗由于电休克、缺氧等情况造成的学习行为或记忆损害[7]。同时有研究表明，奥拉西坦可以重建未损伤的组织结构，减轻及保护脑组织的缺血/再灌注损伤[8]。本研究从细胞凋亡的角度，探讨奥拉西坦对MI/RI的作用，并且初步分析其机制，以丰富奥拉西坦的器官保护作用，为其临床应用夯实基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

SD大鼠32只，雌雄不限，体质量230～260 g，由锦州医科大学实验动物中心提供。奥拉西坦胶囊(石药集团欧意药业有限公司，中国石家庄)；氯化硝基四氮唑蓝(nitroblue tetrazolium，NBT)(Amresco公司，美国)；Bcl-2、Bax、β-actin一抗和二抗(Proteintech公司，美国)；BCA法蛋白检测试剂盒、显影剂(北京鼎国生物有限公司，中国北京)；原位末端标记法(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick，TUNEL)检测、核蛋白提取试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，中国上海)；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondi alldehyde，MDA)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国南京)；肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase isoenzyme MB，CK-MB)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)含量检测试剂盒(上海酶联生科技技术有限公司，中国上海)。超声波细胞破碎仪(SONICS公司，美国)；切片机、烤片机、生物显微镜(LEICA，德国)；呼吸机、心电监护仪(成都泰盟公司，中国成都)；垂直电泳系统、化学发光凝胶成像(国美伯乐)；高速冷冻离心机(Sigma公司，德国)。

1.2 方法

1.2.1 分组与给药 32只大鼠依据随机数表法分为4组，每组8只：(1)假手术组；(2)MI/RI组；(3)低剂量组(奥拉西坦30 mg/kg)；(4)高剂量组(奥拉西坦50 mg/kg)。手术前均正常饲养，低剂量组和高剂量组的16只大鼠除正常饲养外，通过灌胃方式给予对应剂量的奥拉西坦，1次/d，连续7 d。

大鼠手术前1天晚上开始禁食不禁饮，麻醉后固定大鼠，进行气管插管，连接呼吸机，监测心电图。在大鼠胸骨左缘3、4肋间钝性分离组织，开胸后充分显露心脏，剔除心包，找到左冠状动脉前降支。假手术组仅需要用5-0无损伤缝合线做穿线处理；MI/RI组、低剂量组和高剂量组用5-0无损伤缝合线在左冠状动脉前降支结扎，使心电图ST-T抬高，放松后ST-T回落50%标志造模成功。MI/RI组、低剂量组和高剂量组均结扎30 min，再灌注60 min。

1.2.2 酶联免疫吸附测定 术后立即在各组大鼠右心房取血，静止，离心，吸取上层血清，分别标记并存放在-80℃冰箱中。待所有血清备好后，依照试剂盒说明书检测各组大鼠血清中SOD、MDA、LDH、CK-MB、IL-6的含量。

1.2.3 NBT染色 取血后每组随机选取3只大鼠，将心脏取下后去除心房及右心室，放入-20℃冰箱速冻1 h，待组织稍硬后取出，将心室切成等厚的5片，放入预配置的0.1%NBT中，37℃恒温水浴染色。正常心肌是NBT着色部分，显示成暗紫色；NBT不着色部分是梗死心肌，显示成红色或苍白色。以此辨别梗死区与非梗死区心肌。心肌梗死面积百分比=梗死心肌面积/心肌总面积×100%。

1.2.4 TUNEL染色 每组取5只大鼠，取部分心肌组织，置于4%多聚甲醛液，制作成石蜡切片。TUNEL染色时，2次脱蜡、浸泡复水、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)漂洗、孵育，DAB避光显色，苏木素复染，在生物显微镜下拍照。在每张切片中随机选取10个视野，计数。心肌细胞凋亡率=凋亡细胞个数/所有细胞个数×100%。

1.2.5 蛋白表达的检测 每组取5只大鼠，取部分心肌组织提取核蛋白。通过BCA试剂盒来检测蛋白浓度，制作蛋白样品。电泳、转膜、BSA封闭、洗膜。切割后分别和制备的Bcl-2(1∶2 000)、Bax(1∶1 000)和β-actin(1∶5 000)一抗充分混匀，孵育过夜。洗膜，杂交，再次洗膜。加入ECL显色后，检测电泳条带。Bcl-2/Bax比值的变化是细胞凋亡水平的标志。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 4组大鼠血清LDH和CK-MB含量比较

与假手术组相比，MI/RI组大鼠血清中LDH和CK-MB含量显著增加(P<0.05)；与MI/RI组相比，低剂量组和高剂量组大鼠血清中LDH和CK-MB含量显著降低(P<0.05；表1)。

表1 4组大鼠血清LDH和CK-MB含量比较

2.2 4组大鼠心肌梗死面积比较

假手术组均染成暗紫色，没有发生心肌梗死。与假手术组相比，MI/RI组大鼠心肌梗死面积百分比显著增加(36.2%和0.0%，P<0.05)；与MI/RI组相比，低剂量组和高剂量组大鼠心肌梗死面积百分比显著降低(36.2%和13.6%和22.3%，P<0.05；图1)。

图1 4组大鼠心肌梗死面积比较

2.3 4组大鼠心肌细胞凋亡比较

与假手术组相比，MI/RI组大鼠心肌细胞凋亡率显著增加(45.4%和7.9%，P<0.05)；与MI/RI组相比，低剂量组和高剂量组大鼠心肌细胞凋亡率显著降低(45.4%和30.6%和21.3%，P<0.05；图2)。

图2 4组大鼠心肌细胞凋亡比较

2.4 4组大鼠血清IL-6、SOD、MDA含量比较

与假手术组比较，MI/RI组血清中IL-6和MAD含量显著增加(P<0.05)，而SOD显著减少(P<0.05)；与MI/RI组比较，低剂量组和高剂量组大鼠血清中IL-6和MAD含量显著降低(P<0.05)，而SOD显著增加(P<0.05；表2)。

表2 4组大鼠血清IL-6、SOD、MDA含量比较

2.5 4组大鼠心肌组织Bcl-2/Bax比值比较

与假手术组比较，MI/RI组大鼠的Bcl-2/Bax比值显著下降(0.19和1.96，P<0.05)；与MI/RI组比较，低剂量组和高剂量组大鼠的Bcl-2/Bax比值显著上升(0.19和0.47和1.16，P<0.05；图3)。

图3 4组大鼠心肌组织Bcl-2/Bax比值比较

3 讨 论

早期的急性心肌梗死患者，往往可以通过药物、手术及经皮冠状动脉介入术等方法恢复血管再通、缩小梗死面积，从而降低心脏不良预后[9]。但急性心肌梗死患者在恢复有效灌注后，反而会骤然增加心肌损伤[10]，甚至不可逆[11]，即MI/RI[12]。线粒体会产生活性氧自由基(oxygen free radical，OFR)，这是一类具有超高生物学活性的含氧化合物[13]。当组织发生缺氧时，线粒体会迅速生成大量OFR，超高水平的OFR会对核酸、蛋白分子产生氧化作用，导致细胞膜结构改变和功能障碍，这种现象被称为氧化应激。在发生氧化应激反应时，大量的活性氧与线粒体DNA直接接触，可以使DNA双链断裂或丢失，DNA损伤后可以直接激活Bcl-2家族的促凋亡蛋白在线粒体膜表达，导致内源性细胞凋亡诱发一系列炎症反应[14]。Bcl-2/Bax比值是决定细胞是否凋亡的关键[15]。

本研究中采用结扎冠状动脉前降支的方法建立了大鼠MI/RI模型，结果表明，与假手术组相比，MI/RI组心肌梗死面积百分比、心肌细胞凋亡率、血清中CK-MB、LDH、MDA和IL-6含量均显著增加，而SOD和Bcl-2/Bax比值显著减少。可以看出，缺血细胞的线粒体膜稳定性及氧自由基清除能力下降，心肌存在炎症反应、氧化应激反应和细胞凋亡。本研究结果表明，经过奥拉西坦预处理的大鼠发生MI/RI时，心肌梗死面积百分比、心肌细胞凋亡率、血清中CK-MB、LDH、MDA和IL-6含量均显著降低，而SOD和Bcl-2/Bax比值显著增加，提示奥拉西坦对MI/RI具有一定的保护作用。

综上所述，奥拉西坦可促进活性氧自由基清除，维持线粒体膜稳定，下调氧化应激反应水平，抑制线粒体途径的细胞凋亡，降低炎性反应。