肌细胞增强因子2C在胃癌患者中的表达及其临床意义

孙成相 丁志海

1天津医科大学中新生态城医院普外科300467；2天津海滨人民医院普外科300280

0 引 言

据2018 年的数据，胃癌的发病率在所有恶性肿瘤中排名第5，死亡率位居第3，平均每12 位因恶性肿瘤而死亡的患者中就有1 例为胃癌患者[1]。世界上每年有数以百万计的新发胃癌患者[1-2]。胃癌的发病率因地理位置和经济条件不同具有明显的差异，东亚地区人群的胃癌发病率很高，我国平均100 000 人中就有20.7 例胃癌患者。胃癌严重威胁人们的生命健康[3]。因此，需要寻找与胃癌预后相关的靶点，针对可能预后不良的患者给予更早、更积极的治疗。

肌细胞增强因子2C（myocyte enhancer factor 2C,MEF2C）位于人类5 号染色体5q14.3，是MADS转录增强因子家族中的一员，其编码的蛋白质主要在肌生成中发挥作用。MEF2C 蛋白中具有DNA 结合位点和转录活性位点，能维持肌肉细胞的分化，该基因的突变会导致认知障碍，运动障碍和癫痫[4-8]。近些年的研究结果表明，MEF2C 在恶性肿瘤的发生和进展中也发挥重要作用。

1 资料和方法

1.1 临床资料

选择2016 年1 月至2016 年12 月，天津医科大学中新生态城医院和天津海滨人民医院收治的经手术治疗的胃癌患者66 例。其中，男性44 例，女性22 例，年龄（47.9±9.2）岁。纳入标准：胃癌术后病理诊断明确，病理信息和实验室检查信息记录完整；术前没有经过化学治疗和放射治疗；胃癌组织蜡块标本较多，足够进行重新切片和染色；术前无其他严重的基础性疾病。排除标准：术前接受过化学治疗和放射治疗。收集患者的肿瘤组织标本和相应的癌旁正常组织样本，并于患者术后3 年内进行电话随访，记录相关病情数据。所有患者均于术前签署标本可作为科研使用的知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 主要材料与仪器

免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），抗MEF2C 抗体（英国Abcam 公司），二氨基联苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）（北京康为世纪生物科技有限公司），苏木素（北京索莱宝科技有限公司）。CX33 显微镜（日本奥林巴斯公司），RM2235型石蜡切片机（德国Leica 公司）。

1.2.2 免疫组织化学检测方法

将病理蜡块切成4 μm 的白片平展于阳离子防脱玻片上，置于烘箱内在70 ℃下处理30 min 后，立即放于二甲苯中脱蜡40 min（二甲苯，20 min；二甲苯，20 min），然后依次放入梯度乙醇溶液（体积分数100%乙醇，10 min；100%乙醇，10 min；95%乙醇，10 min；75%乙醇，10 min）中进行水化。将切片置于流动的自来水下冲洗10 min，彻底洗净乙醇残留。切片经磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗后，置于枸橼酸盐抗原修复液中，于微波炉中高温煮沸，并持续沸腾10 min，打开蛋白质相互交联的高级结构。将切片从微波炉中取出后，静置冷凉至室温，然后后加入体积分数为3%的H2O2溶液，室温孵育10 min，以灭活内源性的过氧化物酶。于玻片上滴加牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液，置于37 ℃的湿盒中孵育30 min，封闭非特异性结合位点，然后甩去该溶液。PBS 清洗切片后，加入经抗原稀释液稀释后的一抗（1∶100）覆盖组织。切片置于湿盒内密封，4 ℃孵育过夜。取出切片经PBS 反复清洗后，加入二抗，放置于湿盒内，室温孵育1 h。PBS 清洗后，滴加配好的DAB 进行显色，所有切片控制显色时间均为2 min。切片经清洗后再加入苏木素3 min 进行细胞核复染，后经盐酸乙醇溶液分化，氨水返蓝，自来水冲洗后，进行梯度脱水（体积分数75%乙醇，1 min；95%乙醇，1 min；无水乙醇，3 min；无水乙醇,3 min；二甲苯，5min；二甲苯，5 min）。中性树胶封片后由病理医师进行蛋白表达量的评估。

1.2.3 临床样本生物信息学分析

通过基因表达谱交互分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA），在The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据库中获取临床样本619例，其中包括408 例胃癌组织样本和211 例正常胃组织样本。通过GEPIA 分析MEF2C 基因在胃癌组织和正常胃组织中的差异。以|log2FC|＞1，P＜0.01，抖动值0.4 为参数，进行基因表达箱式图的绘制。

从TCGA 数据库中下载2 个胃癌队列的RNA-seq数据和相关的患者信息，以MEF2C 的中位表达分为高表达组和低表达组，使用Kaplan-Meier 方法进行总生存时间的分析，以Logrank 方法进行统计检验。

1.3 统计学方法

患者生存差异分析使用Logrank 方法进行统计检验，两组患者MEF2C 的表达量与病理之间的相关性使用χ2检验。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 生物信息学分析结果

基于TCGA 公共数据库，通过GPEIA 分析MEF2C 的mRNA 在胃癌组织和正常胃组织中的表达情况，共分析胃癌组织408 例及正常胃组织211例。结果表明，MEF2C 的mRNA 在胃癌组织中显著高表达，差异具有统计学意义（P＜0.05）。（图1）。

图1 胃癌组织中肌细胞增强因子2C 的mRNA 表达

为了进一步研究MEF2C 的表达与胃癌患者长期预后的关系，从TCGA 数据库中下载了2 个胃癌数据集，其中一个包含96 例胃癌组织标本和96 例正常胃组织标本，另一队列包含288 例胃癌组织标本和288 例正常胃组织标本。利用Kaplan-Meier 分析了MEF2C 在胃癌患者预后中的作用。在两个队列中MEF2C 高表达的患者总生存时间较MEF2C低表达者短（图2），差异具有统计学意义（均P＜0.05），提示胃癌中MEF2C 高表达的患者预后较差。

2.2 MEF2C 在胃癌组织中的表达

免疫组化结果显示，MEF2C 主要定位于细胞核中，胃癌组织中MEF2C 的表达异质性较明显，其中有22 例标本中表达较低，44 例胃癌标本中表达较高；癌旁的正常胃组织中，MEF2C 基本不表达。（图3）

2.3 MEF2C 蛋白表达水平与胃癌患者的临床病理特征的相关性

为了阐明MEF2C 在胃癌发生和进展中的作用，分析比较了MEF2C 高表达组和MEF2C 低表达组患者的临床病理特征差异，包括年龄、性别、肿瘤分级、肿瘤大小、淋巴结转移和肿瘤复发，见表1。分析结果表明，66 例胃癌患者在年龄和性别分布上的差异无统计学意义（均P＞0.05），可以保证数据的可比性。此外，MEF2C 的表达量和肿瘤分级及淋巴结转移没有明显的相关性（均P＞0.05)。χ2检验结果表明，MEF2C 的表达量与患者手术时肿瘤大小（P=0.022）和复发（P=0.015）的相关性有统计学意义。

3 讨论与结论

尽管胃癌相关的死亡人数在下降，但胃癌在世界范围内仍然是患者数最多的几种癌症之一[9-13]。胃癌给全球医疗造成了严重的负担[10,12,14]。

图2 肌细胞增强因子2C 表达与胃癌患者生存率的相关性

图3 胃癌组织和癌旁正常组织中肌细胞增强因子2C 免疫组化结果

表1 肌细胞增强因子2C 蛋白表达与胃癌患者临床病理特征的相关性分析

MEF2C 作为肌细胞增强因子中的一员，主要在肌肉细胞和心肌细胞中发挥作用，与肌肉细胞的生长、平滑肌的凋亡和癫痫等相关[15-19]。MEF2C 可作为多种蛋白发挥作用的中间载体，如大丝裂原活化蛋白激酶1（big mitogen-activated protein kinase 1,BMK1）。BMK1 为有丝分裂有关的蛋白，可以通过使MEF2C 387 位的丝氨酸残基磷酸化发挥生物学功能，从而显著增强MEF2C 的转录因子的活性，导致C-jun 基因转录的增加[20]。BMK1 作为MEF2C 的上游基因，与多种癌症的侵袭及维持肿瘤细胞的干性相关[21-22]。另外，MEF2C 不仅参与了肌细胞相关的功能，它通过调节神经突触的数量，在海马依赖性的记忆和学习中也扮演着重要的角色，对于神经皮层中正常的神经发育至关重要[6,23-26]。在免疫系统中，MEF2C的表达量影响了B 细胞的增值和B 细胞抗原受体（B-cell receptor,BCR）的敏感程度，是生发中心B 细胞诱导和产生IgG1 抗体所必需的[27-30]。

MEF2C 在肿瘤中同样发挥着重要作用。Sereno等[31]研究发现，在乳腺癌的脑转移过程中，MEFC2的表达量逐渐升高，参与了脑转移过程。血液系统肿瘤中，Zhao 等[32]发现，MEF2C 的突变导致C-jun 表达增高，从而促进弥漫性大B 细胞淋巴瘤的进展。Zhang 等[33]发现，MEF2C pre-mRNA 的可变剪切影响了正常肌细胞的活性，并促进了横纹肌肉瘤的发生。有研究者在研究乳腺癌脑转移模型中，将小鼠乳腺癌细胞注射到颈动脉中，7 d 后在脑中发现转移灶，高通量测序发现，在脑转移瘤和肿瘤周围的星形胶质细胞中，MEF2C 表达均上调。类似的结果在人乳腺癌患者切除的脑转移瘤中也被发现，证实了MEF2C 在乳腺癌脑转移过程中也发挥着作用[31]。Kang 等[34]的研究结果表明，MEF2C 参与了肿瘤细胞的耐药，通过对5-氟尿嘧啶耐药细胞系的研究发现，MicroRNA-551a/MEF2C 轴在耐药细胞系中显著上调，参与了肿瘤细胞的耐药机制。在一项对751 例小儿急性髓细胞白血病的临床研究中发现，MEF2C mRNA 高表达的患者在一个疗程的化疗结束后较其他患者的完全缓解率低，并且总生存情况也较差，复发风险也更高。在小儿急性髓细胞白血病中，MEF2C 的高表达被认为是不良预后的预测指标。

本研究中，首先使用生物信息学的方法，分析了公共数据库TCGA 中的胃癌和正常标本中的MEF2C 的表达，结合生存分析，显示MEF2C 高表达的胃癌患者预后更差，术后生存时间更短，提示MEF2C 与胃癌患者的预后相关。为了进一步验证该假设，本研究中分析66 例胃癌患者的病理和预后信息，对术后胃癌组织标本进行免疫组化染色分析，发现MEF2C 在胃癌组织中普遍高表达，而在正常胃组织中鲜有表达，而且MEF2C 高表达患者的肿瘤体积更大，术后更易复发。Zhang 等[35]的研究结果表明，MEF2C 在导管型胰腺癌中高表达，并且促进了肿瘤的侵袭和转移。

综上所述，MEF2C 在胃癌组织中高表达，促进了肿瘤的生长和复发，可以考虑将MEF2C 高表达作为胃癌预后的预测指标。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突