B3GNT3在胰腺癌组织中的表达及其临床意义

陈靖 张伟华 许晨

1天津医科大学肿瘤医院胰腺肿瘤科，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室300060；2天津市人民医院肛肠外科300191

0 引 言

胰腺癌因其极高的病死率和恶性度，被认为是世界上恶性度最高、进展最快和结局最差的癌症之一[1]。2019 年，美国胰腺癌患者人数为56 770 例，其中由于胰腺癌死亡的患者高达45 750 例。胰腺癌发病率位于美国癌症发病率的前10 位，虽然其发病率没有男性前列腺癌和女性乳腺癌高，但是其病死率高居所有肿瘤的第4 位。尽管胰腺癌的诊疗技术已有所进步，但在所有级别的胰腺癌中，患者5 年生存率仅为9%[2]。胰腺癌的主要危险因素为吸烟、慢性胰腺炎家族病史、非O 型血[3]以及职业风险等[4]。胰腺癌最主要的2 种类型是胰腺腺癌和内分泌肿瘤，前者约占所有病例的85%左右，是胰腺癌的主要类型[5]。由于胰腺癌的进展十分迅速，其确诊后5 年生存率很低。虽然手术切除是包括胰腺癌在内的所有肿瘤治疗的基石，但是一般只有不到20%的胰腺癌患者可以接受手术切除，且一般发生在晚期，许多胰腺癌患者在行根治性手术后仍会复发。目前，辅以放疗、化疗、靶向治疗和中药治疗后，胰腺癌患者的预后已经得到很大的改善[6]。但目前，尚缺乏用于胰腺癌早期发现的有效且灵敏的诊断手段，主要方式是腹部不适之后的电子计算机断层扫描（computed tomography，CT）及核磁共振检查，此时确诊患者一般已达晚期。因此，发掘一种新型而灵敏的生物标记物，有助于对胰腺癌的认识、检测及治疗，从而进一步改善患者预后。

β-1，3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶3（β-1,3-N-acetylglucosamine aminotransferase 3，B3GNT3）属于β3GlcNAcT 基因家族。B3GNT3 基因位于19q13.1 染色体上，该家族至少包括8 个不同的β3GlcNAcTs[7]。B3GNT3 属于Ⅱ型跨膜蛋白，负责聚N-乙酰氨基乳糖胺链的生物合成和二聚唾液酸路易斯A 的骨架结构，并在L-选择素配体的生物合成中起重要作用。许多β3GlcNAcT 家族成员与肿瘤的发生和发展密切相关。例如，与非侵袭性膀胱癌相比，B3GNT2在侵袭性膀胱移行细胞癌中的表达大大降低，表明B3GNT2 可能参与了肿瘤的进展[8]。多项研究结果表明，B3GNT3 的表达量与很多恶性肿瘤的发展和进展相关，如宫颈癌[9]、非霍奇金淋巴瘤[10]、非小细胞肺癌[11]、神经母细胞瘤[12]及结肠癌等[13-14]。近年来，研究者也证明了B3GNT3 可促进肺癌的进展及不良预后[15]。上述研究结果提示，B3GNT3 可能作为多种肿瘤的诊断生物标志物及相关治疗的潜在生物靶点。然而，关于B3GNT3 在胰腺癌组织中的表达及其临床意义的研究还很少，有待于进一步探究。本研究旨在探究B3GNT3 在胰腺癌组织及癌旁正常组织中的表达及其与临床病理特征的关系。本研究结果有助于进一步发现B3GNT3 在胰腺癌发生、发展中的作用，为胰腺癌的早期发现和临床检测、治疗提供了新的思路，对于胰腺癌患者的预后分析也有重要的临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2013 年3 月至2018 年3 月，天津医科大学肿瘤医院收治的经手术治疗的胰腺癌患者78 例。其中，男性44 例，女性34 例，年龄53.2 岁±12.1 岁。全部病例均经过临床病理证实，并具有完整的病例资料。收集患者的肿瘤组织标本和相应的癌旁正常组织样本。根据AJCC-TNM-2010 分类系统和WHO/ISUP-2016 系统分别评估肿瘤分期和分级。本研究以1964 年赫尔辛基宣言和随后所有修订案中规定的道德标准为基础，所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 主要材料与仪器

二氨 基 联 苯 胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）（美国Cell Signaling Technology 公司），免疫组化Anti-B3GNT3 抗体（ab251758，美国Abcom 公司）。

RM2235 型石蜡切片机（德国Leica 公司），CX33型显微镜（日本奥林巴斯公司）。

1.2.2 免疫组织化学检测

将病理组织石蜡包埋并切片，此后放入65 ℃的烘箱中20 min，使石蜡变软。将组织切片充分浸入二甲苯溶液中处理5 min，取出后再置于另一新的二甲苯溶液中继续浸泡5 min，梯度乙醇溶液处理（100%、95%、90%、80%，各5 min）。取出组织切片并置于流水下冲洗，以充分去除乙醇残留。将处理过的组织切片放入盛满磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）的抗原修复盒中洗涤5 min，重复3 次。将组织切片置于盛满0.01 mol 枸橼酸盐抗原修复液（pH=6.0～6.5）的抗原修复盒中，封盖后在微波炉中高火处理5 min，中低火处理10 min，取出后冷却至室温。用PBS 缓冲液洗涤切片5 min，重复3 次，用滤纸擦干切片上多余液体，将切片置于湿盒中，每张切片滴加体积分数为3%的H2O2溶液40 μl，避光孵育20 min，以阻断内源性过氧化物酶。用PBS洗涤5 min，重复3 次，再次用滤纸擦干切片上多余液体。将切片置于湿盒中，每张切片滴加一抗40 μl，4 ℃避光过夜孵育。次日拿出湿盒复温30 min 后，用PBS 洗涤5 min，重复3 次，并用滤纸擦干切片上多余液体。将切片置于湿盒中，每张切片滴加二抗1 滴，室温下避光孵育1 h。用PBS 洗涤5 min，重复3 次，用滤纸擦干切片上多余液体。每张切片滴加配好的DAB 工作液50 μl，染色2 min 后，用自来水冲洗5 min 终止染色。用50 μl 苏木素，复染30 s 后，用自来水冲洗5 min 终止染色。将组织切片用梯度乙醇溶液处理（75%、1 min，85%、1 min，95%、1 min，100%、1 min，100%、3 min），然后将组织切片充分浸入二甲苯溶液中处理5 min，取出后再置于另一新的二甲苯溶液中继续浸泡5 min。最后，用中性树胶进行封片，晾干，用显微镜观察并采集图像。

显微镜观察时，随机选取5 个不同的视野，依照阳性细胞比例和阳性染色强度2 个指标评定组织切片中B3GNT3 的染色水平。阳性细胞比例评分标准：肿瘤细胞阳性百分数为0%时，记为0 分，1%～29%时，记1 分，30%～65%时，记2 分，66%～100%时，记3 分。阳性染色强度评分标准：阴性染色记0 分；低度染色记1 分；中度染色记2 分；高度染色记3 分。以阳性细胞百分比评分和染色强度评分的乘积判断表达情况，其中结果＜1 分时，记为0 分；结果为1、2 或3 时，记为1 分；结果为4 或6 时，记为2 分；结果为9 时，记为3 分。

1.2.3 临床样本生物信息学分析

通过基因表达谱交互分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）数据库获取临床样本350 例，其中包括179 例胰腺癌组织样本和171 例癌旁正常组织样本。通过GEPIA 数据库分析B3GNT3 的mRNA 在胰腺癌组织和癌旁正常组织中的差异。

1.4 数据学方法

采用Graphpad 7.0 统计学软件处理数据。定量数据采用均数±标准差（Mean±SD）表示。两组比较时，采用t 检验；比较临床病理特征与蛋白表达间的关系时，采用χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 生物信息学分析结果

B3GNT3 在多种肿瘤中异常表达并提示不良预后。为了更好地阐明B3GNT3 在胰腺癌中的作用，通过GPEIA 分析B3GNT3 的mRNA 在胰腺癌组织和癌旁正常组织中的表达情况，共分析胰腺癌组织179 例及癌旁正常组织171 例。结果表明，B3GNT3的mRNA 在胰腺癌组织中显著高表达（P＜0.05）（图1）。为了进一步证明B3GNT3 在胰腺癌进展演变中发挥的作用，利用Kaplan-Meier 分析B3GNT3 与胰腺癌患者预后之间的关系。结果表明，B3GNT3 表达较高的患者中，总生存率和无病生存率都较低（图2A和2B）。上述结果提示，B3GNT3 在胰腺癌组织中的表达水平偏高，并与胰腺癌患者的预后生存期相关。

图1 胰腺癌中β-1，3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶3（B3GNT3）的mRNA 表达

2.2 B3GNT3 在各种肿瘤组织中的表达

生物信息学分析结果显示，B3GNT3 在多数常见肿瘤中的表达是阴性的，而在甲状腺癌、结直肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌及胰腺癌中呈现高表达（图3）。因此，进一步探究了B3GNT3 蛋白在结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌及肝癌中的表达情况。结果表明，B3GNT3 在乳腺癌中也明显高表达，且发现B3GNT3 主要表达在细胞质内（图4）。

2.3 B3GNT3 在胰腺癌组织中的表达

为了探究B3GNT3 在胰腺癌的进展中的角色。本研究中，运用免疫组织化学染色方法检测78 例胰腺癌组织中的B3GNT3 的表达情况。结果显示，B3GNT3 主要定位于胞浆，其表达量在胰腺癌组织中明显高于癌旁正常组织（图5A）。根据染色的强度，将胰腺癌患者分为B3GNT3 高表达组和B3GNT3 低表达组（图5A）。分组后发现，B3GNT3 在癌旁正常组织中的表达量显著降低（图5B）。上述结果提示，B3GNT3 与胰腺癌的进展明显相关。

2.4 B3GNT3 蛋白表达水平与胰腺癌患者的临床病理特征的相关性

为了阐明B3GNT3 在胰腺癌进展中的作用，分析比较了B3GNT3 高表达组和B3GNT3 低表达组患者的临床病理特征差异，包括年龄、性别、肿瘤分期、肿瘤分级、肿瘤大小、淋巴结转移。分析结果表明，B3GNT3 在胰腺癌组织中的高表达与肿瘤分期（P=0.014）、淋巴结转移（P=0.013）和肿瘤大小（P=0.004）明显相关，而与性别、年龄以及肿瘤分级无关（均P＞0.05）。（表1）

图2 β-1，3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶3（B3GNT3）表达与胰腺癌患者生存率的相关性

图3 β-1，3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶3（B3GNT3）在部分肿瘤患者中的表达情况

图4 β-1，3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶3（B3GNT3）在几种常见肿瘤中的免疫组化结果（×200）

图5 胰腺癌组织和癌旁正常组织中β-1，3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶3（B3GNT3）的免疫组化结果

表1 β-1，3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶3（B3GNT3）蛋白表达与胰腺癌患者临床病理特征的相关性分析

2.5 B3GNT3 作为胰腺癌潜在生物标记物分析

上述结果提示，B3GNT3 可能是胰腺癌的一种潜在预后相关生物标记物。因此，对B3GNT3 作为肺癌与胰腺癌的预后标记物，进行了可能性分析。结果表明，B3GNT3 在2 种肿瘤中均可发挥显著的预后生物标记物作用，且在胰腺癌中更加明显（图6）。该结果提示，B3GNT3 有望在胰腺癌的预后预测中发挥作用，并有望成为靶向治疗的靶点。

图6 β-1，3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶3（B3GNT3）作为肺癌和胰腺癌的预后标记物的可能性分析

3 讨论与结论

胰腺癌是一种具有高度侵袭性和恶性的肿瘤，其患者死亡率很高[16]。手术切除对早期胰腺癌患者有效，但由于胰腺癌的早期症状隐匿，至使早期诊断率较低，很多患者往往被诊断时即为晚期。晚期胰腺癌的手术切除率相对较低，常常导致预后不良。尽管近年来关于胰腺癌的诊疗技术取得了巨大进步，分子诊断和靶向治疗技术不断完善，但胰腺癌仍是一种死亡率很高的高度侵袭性疾病。目前，针对胰腺癌，仍然缺乏有效的用于预防、诊断，以及转移和预后预测的生物标志物[17]。大量的研究结果表明，B3GNT3 在多种肿瘤的发生、发展中发挥巨大作用。B3GNT3 是19q13.1 扩增的一个新的生物标志物，在结肠癌、宫颈癌、食管癌、肝癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤以及非小细胞肺癌组织中高表达，尤其是在神经母细胞瘤和非小细胞肺癌组织中表达更为明显。本研究中，基于生物信息学分析，发现B3GNT3 在多种肿瘤中高表达，B3GNT3 在胰腺癌组织中的mRNA 表达水平明显高于癌旁正常组织，且B3GNT3 表达较低的胰腺癌患者的总生存率和无病生存率都较高。这些结果与其他研究者对B3GNT3 与其他肿瘤进行研究后所得出的结论是一致的。

为了进一步探究B3GNT3 在胰腺癌的进展中的作用，对78 例患者的胰腺癌组织进行了免疫组织化学染色。结果表明，B3GNT3 在胰腺癌组织中的表达量要比癌旁正常组织高很多。Cerhan 等[10]发现，B3GNT3 与免疫功能和炎症有关，并在淋巴细胞运输和迁移中起着重要的作用，导致肿瘤细胞的生存和转移。本研究中发现B3GNT3 在胰腺癌组织中的高表达与肿瘤的分期、淋巴结转移和肿瘤大小明显相关（均P＜0.05），但与性别、患者年龄和肿瘤复发的相关性无统计学意义（均P＞0.05）。该结果与先前得出的B3GNT3 与癌转移相关的结论相一致，但关于B3GNT3 与癌症复发的关系，二者结果相异，有待于进一步通过实验来分析具体原因。研究结果表明，B3GNT3 的基因座与胰腺癌中CA19-9 水平相关[14]。本研究结果表明，B3GNT3 在甲状腺癌、结直肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌及胰腺癌中呈现高表达，且B3GNT3 往往与肿瘤的不良预后密切相关。本研究中，初步证实了B3GNT3 与胰腺癌之间的关系，为进一步探究B3GNT3 与胰腺癌的相关性奠定了研究基础。B3GNT3 与胰腺癌临床病理的相关性与大多数肿瘤类似，其与B3GNT3 在大多数肿瘤上发挥的作用相类似。

综上，本研究的结果有助于进一步理解和认识B3GNT3 与胰腺癌的关系。基于B3GNT3 与胰腺癌之间的关系，可以认为B3GNT3 有望成为胰腺癌重要的治疗靶点和一个潜在的生物标志物，但是具体机制有待于进一步研究。下一步的研究将更加全面地分析B3GNT3 在胰腺癌中的功能，其中将通过构建B3GNT3 基因质粒表达载体，将其过表达或沉默，并观察其功能学行为的改变，并将构建小鼠模型等来研究B3GNT3 对胰腺癌的增值、迁移以及肿瘤形成等方面的影响，以期进一步探索B3GNT3 对胰腺癌的分子作用机制。