新疆野生和栽培一枝蒿粗多糖免疫调节活性的稳定性分析

李泉晓 冯双双 张爱莲

新疆大学生命科学与技术学院，新疆生物资源与基因工程重点实验室，乌鲁木齐830046

0 引 言

中草药常被用来治疗各种疾病，其水提物有效成分主要为多糖、生物碱、苷类和挥发油等[1-3]。大量研究结果证明，中草药提取物是重要的免疫调节剂[4]。例如中草药成分中的多糖可激活机体免疫细胞，包括T 淋巴细胞、B 淋巴细胞、树突状细胞（dendritic cells,DCs）、自然杀伤细胞及巨噬细胞等；此外还可活化补体，刺激抗体分泌和促进细胞因子产生，在增强免疫力中发挥着重要作用[5-7]。近年来，中草药提取物用于抗肿瘤药物及疾病疫苗佐剂的研究已成为热点。中草药多糖包括白芷多糖、牛膝多糖、菊粉多糖、甘草多糖、一枝蒿多糖等，可显著提高肿瘤患者的免疫力，通过机体自身免疫功能杀伤肿瘤细胞，从而减轻化学药物治疗和放射治疗对免疫器官的损伤，其作为流感病毒、艾滋病病毒、乙型肝炎病毒等疫苗佐剂可显著增强疫苗的免疫效果[8-12]。

DCs 是体内专职的抗原呈递细胞，其主要功能是捕获、加工、提呈抗原给初始T 淋巴细胞[13]。中草药提取物尤其是多糖可通过与DCs Toll 样受体结合促进DCs 成熟，进而释放促炎症因子、细胞因子及趋化因子等，使宿主产生一种强烈的免疫反应对抗外界病原体[14-15]。DCs 成熟的一个重要标志为共刺激分子CD40、CD80、CD86 和主要组织相容性复合体-Ⅱ的上调。这些共刺激分子也为T 细胞活化提供了重要信号[16]。

新疆一枝蒿为菊科岩蒿植物，以全草入药。其提取物包含多糖、黄酮等，其中多糖类化合物具有降低炎症反应、抑制肿瘤生长及抗病毒等多种生物学功能[17]。笔者所在课题组前期研究结果发现，新疆野生一枝蒿粗多糖（wild Artemisia rupestris L.crude polysaccharides,WARCP）在体外可刺激DCs 成熟，其作为佐剂可显著提高疫苗的免疫效力[18]。然而对于新疆一枝蒿的最佳储存温度与状态了解甚少，故本研究通过检测WARCP 和新疆栽培一枝蒿粗多糖（cultivated Artemisia rupestris L.crude polysaccharides,CARCP）对DCs 表面分子CD40 和CD86 表达的影响，来探讨两者于不同温度（4 ℃、-20 ℃、-80 ℃）储存时的免疫调节活性差异，为新疆一枝蒿保持良好的免疫调节活性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

新疆野生一枝蒿、新疆栽培一枝蒿（市售），青霉素-链霉素溶液（双抗）、RPMI-1640 培养基（美国HyClone 公司），胎牛血清（以色列Biological Industries公司），藻红蛋白（phycocyanin，PE）标记的抗小鼠CD11c 抗体、异硫氰酸荧光素（flourescein isothiocyanate，FITC）标记的抗小鼠CD40 抗体、别藻蓝蛋白（allophycocyanin，APC）标记的抗小鼠CD86 抗体（美国BD 公司），鼠源粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（美国PeproTech 公司），脂多糖（美国Sigma 公司），石油醚、无水乙醇、正丁醇（天津市富宇精细化学品开发有限公司）。

健康清洁级6～8 周龄C57BL/6 雌性小鼠12 只，体质量范围18～22 g，购自新疆医科大学实验动物中心，许可证号SCXK（新）2003-0001。小鼠于动物房内分笼饲养，温度（22±2）℃，相对湿度（55±10）%，光照节律为12 h 光照/12 h 黑暗，自由进食饮水。本研究所有的动物实验均获得新疆大学动物实验伦理委员会的批准。

TD-5Z 台式低速多管架离心机（四川蜀科仪器有限公司），BD FACSCalibur 流式细胞仪（美国BD公司），Heal Force 生物安全柜[力新仪器（上海）有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 WARCP 和CARCP 的制备与储存

取整株新疆野生一枝蒿和新疆栽培一枝蒿于60 ℃烘箱中干燥，粉碎后用1 L 无水乙醇溶解100 g粉末，混匀，超声1 h；沉淀干燥后，加入1 L 石油醚混合超声1 h，抽滤干燥；再加入1.5 L 蒸馏水超声2 h，旋蒸浓缩至200 ml；加入无水乙醇溶液使浓缩液的体积分数为80%，4 ℃醇沉24 h，抽滤干燥即得WARCP 和CARCP 粉末。然后采用Sevage 法[19]对WARCP 和CARCP 粉末进行除蛋白，具体步骤如下：分别取适量WARCP 和CARCP 粉末，加入100 倍体积的蒸馏水，搅拌均匀直至充分溶解；将氯仿与正丁醇按体积比4∶1 混合（Sevage 试剂），加入上述多糖溶液中混匀进行除蛋白，重复此步骤直至蛋白被充分去除；旋蒸浓缩，加入无水乙醇使浓缩液的体积分数为80%后进行醇沉，抽滤干燥得到去除蛋白的WARCP 和CARCP 粉末。采用蒽酮-硫酸法[17]测定多糖含量，测得WARCP 粉末的多糖含量为30.94%，CARCP 粉末的多糖含量为31.86%。分别取适量WARCP 和CARCP 粉末分装后置于4 ℃、-20 ℃和-80 ℃冰箱中储存6 个月；另取适量WARCP 和CARCP 粉末分别溶于磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）中，过滤除菌，配成质量浓度为10 mg/ml 的母液，置于4 ℃、-20 ℃和-80 ℃冰箱中储存6 个月后用于后续研究。

1.2.2 小鼠髓系DCs 的获取

颈椎脱臼法处死C57BL/6 小鼠，于体积分数为75%的乙醇中浸泡2～3 min；剪取后腿胫骨和股骨，剔肉后置于PBS 中；再置于体积分数为75%的乙醇中消毒1～2 min，PBS 洗4 遍；剪去两端骨头，用1 ml注射器吸取RPMI-1640 培养基冲出骨髓，200×g 离心7 min，弃上清；用含有质量浓度为20 ng/ml 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和体积分数为10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基重悬细胞，以1×106个/ml的浓度接种于细胞培养皿中，每皿6 ml，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养；1 d 后更换一半的培养基，第3 天更换全部培养基，留下半贴壁细胞，第5 天再更换一半的培养基，第6 天收集所有的半贴壁细胞。

1.2.3 流式细胞术检测DCs 表面分子CD40 和CD86 的表达

收集培养至第6 天的未成熟DCs，200×g 离心7 min，弃上清，计数后以5×105个/ml 的浓度接种于24 孔板中培养；分别加入不同剂量的WARCP 和CARCP 刺激DCs，阳性对照组加入100 ng/ml 脂多糖，阴性对照组加入RPMI-1640 培养基；刺激24 h 后收集细胞于离心管中，加入5 ml PBS 终止刺激，200×g离心7 min，弃上清；分别加入PE-CD11c、FITC-CD40和APC-CD86，常温避光染色30 min；加入5 ml PBS终止染色，离心弃上清；用350 μl PBS 重悬细胞，经200 目铜网过滤成单细胞悬液于流式管中，采用流式细胞仪检测DCs 表面分子CD40 和CD86 的表达，FlowJo7.6 软件处理流式细胞术检测结果。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 5.01 统计学软件处理数据，符合正态分布的计量资料采用均值±标准差（Mean±SD）表示，组间比较采用t 检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同温度下以粉末状态储存的WARCP 活性比较

将WARCP 粉末分别于4 ℃、-20 ℃和-80 ℃下储存6 个月，然后溶于无菌PBS 中，以不同剂量的WARCP 刺激DCs，采用流式细胞术检测DCs 表面分子CD40 和CD86 的表达。结果见图1，3 个剂量组的WARCP 粉末均能促进DCs 的成熟，且具有剂量依赖性，但不同温度下储存的WARCP 粉末对DCs 表面分子CD40 和CD86 的表达均无明显影响，其差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

图1 不同温度下以粉末状态储存的WARCP 对DCs 表面分子CD40 和CD86 表达的影响

2.2 不同温度下以溶液状态储存的WARCP 活性比较

将WARCP 粉末溶于无菌PBS 中，配成质量浓度为10 mg/ml 的母液，分别于4 ℃、-20 ℃和-80 ℃下储存6 个月，再以不同剂量刺激DCs，采用流式细胞术检测DCs 表面分子CD40 和CD86 的表达。结果见图2，3 个剂量组的WARCP 溶液对DCs 表面分子CD40 和CD86 的表达均无明显影响，其差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.3 不同温度下以粉末状态储存的CARCP 活性比较

将CARCP 粉末分别于4 ℃、-20 ℃和-80 ℃下储存6 个月后以不同剂量刺激DCs，流式细胞检测结果如图3 所示，不同温度下储存的CARCP 粉末对DCs 表面分子CD40 和CD86 的表达均无明显影响，其差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.4 不同温度下以溶液状态储存的CARCP 活性比较

将CARCP 母液分别于4 ℃、-20 ℃、-80 ℃下储存6 个月，再以不同剂量刺激DCs，流式细胞检测如图4 所示，当CARCP 剂量为10 μg/ml 时，于-20 ℃和-80 ℃下储存的CARCP 溶液，其对应的DCs 表面分子CD40 表达均高于4 ℃下储存的CARCP 溶液，差异均具有统计学意义（均P＜0.05）；当CARCP 剂量为50、100 μg/ml 时，储存温度对DCs 表面分子CD40 的表达无明显影响，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。CD86 表达检测结果表明，3 个剂量组的CARCP 溶液对DCs 表面分子CD86 的表达无明显影响，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.5 相同温度下储存的WARCP 粉末和溶液活性比较

由图5 可知，相同温度下储存的WARCP 粉末与溶液对DCs 表面分子CD40 和CD86 的表达无明显影响，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.6 相同温度下储存的CARCP 粉末和溶液活性比较

图2 不同温度下以溶液状态储存的WARCP 对DCs 表面分子CD40 和CD86 表达的影响

图3 不同温度下以粉末状态储存的CARCP 对DCs 表面分子CD40 和CD86 表达的影响

由图6 可知，相同温度下储存的CARCP 粉末和溶液对DCs 表面分子CD40 和CD86 的表达无明显影响，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

3 讨论与结论

中草药提取物的活性受多种因素的影响，储存温度、储存浓度、储存时间、储存状态等均会改变其营养、保健和医疗等作用。文献报道，马齿苋多糖清除自由基的能力随多糖浓度的升高而增强，随储存时间的延长和储存温度的升高而减弱，因此应在低温条件下储存以保持马齿苋多糖的抗氧化活性[20]。此外，大枣多糖的储存条件对其活性亦有很大影响，在3 种温度下（室温、4 ℃和-18 ℃）储存大枣多糖，其抗氧化活性随储存时间的延长和储存温度的升高而降低，且在较低温度（4 ℃和-18 ℃）储存条件下抗氧化活性变化很小，由此得出结论低温有利于大枣多糖抗氧化活性的保持[21]。

本研究结果显示，WARCP 与CARCP 在低剂量10 μg/ml 时即可明显刺激DCs 的成熟，且WARCP与CARCP 在100 μg/ml 时，与阴性对照组相比，CD40 比例分别上调52%和44%，CD86 比例分别上调32%和16%。文献报道，车前子多糖在100 μg/ml 时CD40比例仅上调6.66%[22]；灵芝多糖在80 μg/ml 时CD86比例上调23.9%[9]，与本研究相当。上述结果表明，储存6 个月后的WARCP 与CARCP 仍具有良好的免疫调节活性。本研究还探讨了于不同温度下储存的WARCP 粉末或溶液对DCs 表面分子CD40 和CD86 表达的影响，结果发现不同储存温度下，无论是粉末状态还是溶液状态的WARCP，其对DCs 成熟的影响无明显差异，表明储存温度和储存状态对WARCP 的免疫调节活性无影响或影响较小。同理本研究探讨了储存温度和储存状态对CARCP 免疫调节活性的影响，结果发现仅在10 μg/ml 时，-20 ℃和-80 ℃储存的CARCP 溶液活性优于4 ℃储存的CARCP 溶液，表明在使用低剂量的CARCP 时，低温储存其活性更优。最后，本研究分析了在相同温度下储存的WARCP 与CARCP 粉末和溶液的活性比较，结果发现，以粉末状态与溶液状态储存的WARCP 与CARCP 均能明显促进DCs 的成熟，但两种状态下对DCs 的影响无明显差异，表明在相同温度下储存状态（粉末与溶液）对CARCP 的免疫调节活性无明显影响。

图4 不同温度下以溶液状态储存的CARCP 对DCs 表面CD40 和CD86 表达的影响

图5 相同温度下储存的WARCP 粉末和溶液对DCs 表面分子CD40 和CD86 表达的影响

图6 相同温度下储存的CARCP 粉末和溶液对DCs 表面分子CD40 和CD86 表达的影响

综上所述，粉末状态的WARCP、CARCP 与溶液状态的WARCP 分别于不同温度下（4 ℃、-20 ℃和-80 ℃）储存，其免疫调节活性差异均无统计学意义（均P＞0.05）；一定剂量的溶液状态CARCP 分别于-20 ℃和-80 ℃下储存，其免疫调节活性明显优于4 ℃下储存（均P＜0.05）；相同温度下储存的WARCP与CARCP 的免疫调节活性均不受储存状态的影响（均P＞0.05）。本研究结果为保持新疆一枝蒿的免疫调节活性提供了保障，也为其作为免疫调节剂提供了重要的参考依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突