黄芪甲苷对人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖及白细胞介素6分泌的影响*

冯美杰，李 蕾，王颖航，徐兢鸿，潘 志△

(1. 长春中医药大学，长春 130117；2. 长春中医药大学附属医院，长春 130021)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)属于系统免疫性疾病，发病机制目前尚未完全明确。RA的病理变化常表现为关节滑膜受到破坏，治疗不及时或治疗不当可引起关节严重畸形和关节功能障碍[1-2]。

研究发现，激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号传导通路是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)诱导RA发病的主要原因，MAPK通路有C-Jun氨基末端激酶、P38和细胞外信号调节激酶三类不同的激酶。研究表明，TNF-α能够明显提高人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(human fibroblast-like synoviocytes，HFLS-RA)蛋白质酪氨酸磷酸化水平，快速激活MAPK通路，在TNF-α浓度为10 ng/mL时这种诱导能力最为明显[3-4]。黄芪甲苷(astragaloside Ⅳ,AS-Ⅳ)作为黄芪活性成分之一，具有非常广泛的生物学效应[5]。此外，黄芪在RA的临床治疗中显现出明显的优势，但其作用机理尚不清楚。因此，本实验采用TNF-α及黄芪甲苷干预细胞以探讨其分子作用机制。

1 材料

1.1 仪器与试剂

SW-CJ-1D超净台(上海乔跃电子有限公司);XDS-100C型倒置显微镜(上海蔡康光学仪器有限公司);MCO-15AC二氧化碳恒温培养箱(日本SANYO公司);RT-6100酶标仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司);3H16RI智能高速冷冻离心机(湖南赫西仪器装备有限公司);165-8000电泳仪(美国伯乐公司);H-DMEM培养基(美国Hyclone公司);胎牛血清(美国Gibco公司);黄芪甲苷标准品(上海源叶生物科技有限公司);TNF-α(美国PEPROTECH公司);MTT(美国Sigma公司);二甲基亚砜(美国Sigma公司);Rat 白细胞介素6 (Interleukin-6，IL-6)、ELISA KIT试剂盒(上海朗顿生物科技有限公司);BCA蛋白浓度测定试剂盒增强型(中国碧云天生物有限公司);c-Jun氨基末端激酶1 (JNK1)抗体(北京博奥森生物技术有限公司);c-Jun氨基末端激酶1/2 (JNK1/2)抗体(北京博奥森生物技术有限公司);Goat anti-Rabbit IgG(H&L)-HRP(北京博奥森生物技术有限公司)。

1.2 细胞

HFLS-RA购自北京北纳创联生物技术研究院，取3～7代用于实验。

2 方法

2.1 细胞培养

将HFLS-RA迅速放入37 ℃温水中，小心快速摇晃至细胞悬液全部溶解，在无菌条件下将细胞悬液移入无菌离心管中，加入培养液后离心弃去上清液，在离心管中加入1 mL培养液，将细胞沉淀混悬，小心吸取移到含有3 mL 10%胎牛血清(FBS)H-DMEM培养基的细胞培养瓶中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中进行培养。本实验研究所用细胞为3代到7代[6]。

2.2 细胞分组及干预方法

细胞按随机数字表法分为5组，空白组：10%FBS培养基培养细胞；TNF-α组：10 ng/mL TNF-α；AS-ⅣH组：10 ng/mLTNF-α+100 μg/mLAS-Ⅳ；AS-ⅣM组：10 ng/mLTNF-α+50 μg/mLAS-Ⅳ；AS-Ⅳ L组：10 ng/mLTNF-α+25 μg/mL AS-Ⅳ(依据文献以及前期预实验确定本实验黄芪甲苷的浓度[7])。

2.3 MTT法检测HFLS-RA的增殖活力

当细胞生长到满足传代条件时(80%)，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，并将细胞密度调整为1×104。按照每孔200 μL将细胞悬液接种于96孔板，将其置于5%CO2、37 ℃培养箱中培养24 h，按照实验分组加药，24 h后加入MTT、DMSO，在490 nm处测定OD值[8-9]。

2.4 ELISA法检测HFLS-RA上清液中IL-6的表达水平

实验分组、加药刺激方法同上，加药后置于培养箱中培养24 h后收集各组细胞上清液，离心后放于-20 ℃保存，按照说明书步骤测定IL-6含量[10-11]。

2.5 Western Blot法检测细胞中JNK1和JNK1/2蛋白表达水平

提取单层贴壁细胞总蛋白，按照增强型BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度，计算电泳上样体积。将蛋白样品置于100 ℃沸水中煮10 min，使蛋白完全变性。制胶(12%分离胶、5%浓缩胶)，上样后以SDS-PAGE电泳法分离蛋白质(80 V 30 min跑浓缩胶，110 V 90 min跑分离胶)，电泳结束后将分离开的蛋白转膜(100 V 85 min)，5%脱脂奶粉封闭2 h后，TBST洗膜3～5次, 每次10 min。孵育一抗4 ℃过夜；室温摇床上孵育二抗1 h，ECL化学发光，于成像系统曝光并测定灰度值[12]。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 AS-Ⅳ对TNF-α诱导的HFLS-RA增殖抑制作用

表1示，与空白组比较，TNF-α组HFLS-RA增殖活力明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)。与TNF-α组比较，AS-Ⅳ各组HFLS-RA的增殖活力受到明显抑制，其中AS-ⅣH的抑制作用最为明显，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 AS-Ⅳ对TNF-α诱导的HFLS-RA增殖抑制作用

3.2 AS-Ⅳ对TNF-α诱导的HFLS-RA 中IL-6表达的影响

表2示，与空白组比较，TNF-α组HFLS-RA上清液中IL-6表达水平明显升高(P<0.01)；与模型组比较，不同浓度AS-Ⅳ组HFLS-RA上清液中所检测的IL-6含量明显降低，其中AS-ⅣH组的IL-6表达水平最低，差异有统计学意义(P<0.01)。

3.3 AS-Ⅳ对TNF-α诱导的HFLS-RA 中JNK1、JNK1/2表达的影响

图1示，与空白组比较，TNF-α组的HFLS-RA内JNK1、JNK1/2蛋白含量明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与TNF-α组比较，AS-Ⅳ各组蛋白含量明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)，其中AS-ⅣH的抵制作用最为明显。

注：1.空白组；2.TNF-α组；3.AS-ⅣH组；4.AS-ⅣM组；5.AS-ⅣL组；与空白组比较：*P<0.05；与TNF-α组比较：#P<0.05图1 各组HFLS-RA JNK1和JNK1/2的表达

表2 各组HFLS-RA上清液中IL-6表达水平

4 讨论

中医根据RA的临床表现和发生发展过程将其归于“痹证”范畴，外邪、营卫不和、素体亏虚是导致痹证的主要原因。目前多数医家对痹证的治疗有一定的共识。如赵靖强调痹证治疗应以扶正祛邪为治则，以温阳行痹为治法[13]。黄芪甲苷是中药黄芪的主要活性成分之一。黄芪作为传统中药材具有扶正补气、固腠理之功效，还可利水消肿、生津养血、行滞通痹、托毒排脓、敛疮生肌[14]，因而临床常用黄芪扶正祛邪以治疗因虚致痹的病证。现代药理学研究发现，黄芪甲苷具有免疫调节、抗病毒、降低血小板黏附力等作用[15-17]。RA的主要特点是滑膜组织增生和关节结构破坏，造成滑膜组织增生和关节结构破坏的主要原因是，RA患者成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocyte，FLS)的增殖和凋亡平衡失调，使FLS不断地 “肿瘤样”增生[18]。有研究表明，TNF-α能刺激滑膜细胞、成纤维细胞、破骨细胞和软骨细胞产生破坏性物质基质金属蛋白酶，导致RA患者滑膜的炎症持续加重，渐进性破坏软骨与骨组织[19]。IL-6是RA的致病源头因素之一,它参与RA致病过程中早期B细胞和T细胞的活化，并参与全程致病过程。TNF-α能促进滑膜细胞中IL-6的产生，IL-6也能增强TNF-α等细胞因子的促炎效应，因此本实验选择IL-6作为评价指标[20]。JNK信号通路参与细胞增殖、分化和凋亡等多种生物学反应，其可被细胞因子、表皮生长因子等多种因素激活，JNK信号通路功能异常可造成慢性炎症和神经退行性病变等多种疾病[21-22]。JNK磷酸化和胶原酶的基因表达恰恰需要TNF-α的诱导，JNK已被鉴定的亚型为1、2和3，JNK1和JNK2基因在全身广泛表达, 而JNK3呈限制性表达，JNK2不足只在关节炎的临床前模型有所显现，但JNK1不足可以减轻滑膜炎症和关节破坏，JNK1也有利于破骨细胞分化。这些都表明，JNK参与RA的滑膜炎症和关节破坏并可能在RA疾病进程中定位，JNK有望成为临上的一个潜在的治疗靶点，调节相关疾病的发生发展。

本研究显示，体外培养的RA-HFLS经TNF-α刺激24 h后，HFLS-RA增殖活力明显升高，随着AS-Ⅳ浓度的增加，HFLS-RA增殖活力逐渐降低，AS-Ⅳ作用浓度与细胞增殖活力之间存在依赖关系。TNF-α能促进滑膜细胞分泌IL-6，从而使炎症加重、软骨破坏。经过黄芪甲苷的干预后，IL-6的水平显著下降，说明黄芪甲苷可通过抑制炎症细胞因子来控制疾病的炎症反应。Western blot检测滑膜细胞蛋白的表达情况显示，JNK1和JNK1/2蛋白在HFLS-RA模型组中表达明显增加。随着AS-Ⅳ浓度升高，JNK1和JNK1/2蛋白表达水平表现为逐渐降低趋势，表明AS-Ⅳ抑制TNFα诱导HFLS-RA细胞增殖呈剂量依赖性。本研究表明，AS-Ⅳ可抑制TNF-α诱导HFLS-RA增殖，减轻滑膜炎症，其分子机制可能与调控JNK信号传导通路的异常活化有关。但AS-Ⅳ对HFLS-RA的作用不仅仅通过抑制JNK信号通路蛋白磷酸化实现，可能还有其他信号通路参与其中，今后尚需进一步研究。