纳豆激酶生理功能及其增产增效与改性研究

马上超，杨 迪，熊 坤，汪兴平*

(1.湖北民族大学 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000； 2.恩施州公共检验检测中心，湖北 恩施 445000)

日本纳豆(natto)的食用历史已有1 000多年，起初是通过家庭手工自然发酵的方式，将其制成调味品；现在已经形成工业化纯菌种发酵生产模式.1975年江户时代在编纂的《江户本家》(HonchoShokkan)一书中，描述了传统发酵大豆-纳豆的有益效果.日本的须见洋行博士长期从事天然食品中溶解血栓酵素的研究，1980年在研究尿激酶(UK)及链激酶(SK)的溶栓机理时，将纳豆置于人工血栓平板上进行孵育，纳豆周围出现了血栓溶解圈[1]；1987年，一种具有强烈的溶解血栓功能的酶从纳豆中提取、纯化出来，命名为纳豆激酶(NattoKinase，NK)[2].血栓是引发心脑血管疾病及其并发症的重要因素，强烈的溶栓功能使纳豆激酶备受关注，其功能、机制及相关的高效生产研究迅速展开.1992年，科研工作者已经展开纳豆激酶基因序列的研究；2015年纳豆激酶作为纳豆类保健食品的功效成分已经获得批准.时至今日，含纳豆激酶成分的保健品已经投放市场，但是纳豆激酶的研究并未停止，人们仍然在不断地发现溶栓以外的生理功能，并通过多种手段提高其产量、有效性、稳定性和安全性.本文就近年来的研究成果进行综述，为纳豆激酶的深度开发奠定基础.

1 纳豆激酶的生物活性功能

1.1 纳豆激酶的溶栓功能

据报道，传统的溶栓药物，例如阿司匹林[3]、华法林[4]阻止血栓形成的机理主要是发挥扩张血管、抑制血小板黏附作用，但有引发心梗、脑梗、脑出血的可能，而且需要长期服用，不能从根本上解决血栓问题.而常用的尿激酶、链激酶、纤溶酶原激活剂(t-PA)等可以直接溶解血栓，斩断纤维蛋白，但是只能在梗塞发生后，作为抢救药品，需要限量使用，超量会引发大出血，且价格昂贵.

纳豆激酶提取液在纤维蛋白平板上显现出溶解效果后，继而开展有关纳豆激酶溶栓活性的研究.李静等[5]报道纳豆激酶活性是尿激酶1.36倍，纳豆激酶对血栓的溶解效果较尿激酶更显著.邵玉英等[6]报道纳豆激酶通过延长纤维蛋白凝固时间，抑制凝血酶形成，发挥抗血小板聚集及抗凝血作用.纳豆激酶的溶栓效果显著，国内已有几十家公司在生产或销售纳豆类保健产品.

纳豆激酶的溶栓途径多样，现有作用机理研究表现在以下多方面.纳豆激酶可以激活尿激酶原生成尿激酶，间接溶解陈旧血栓，纳豆激酶与血管内壁细胞作用，诱导内源纤溶酶原激活剂(t-PA)的产生，同时抑制纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)活性，促使t-PA增加[7-9].在人血小板Ca2+动员的体外实验中，纳豆激酶明显提高血小板环磷酸腺苷(cAMP)水平，血抑制血小板凝集[10].在动物溶栓实验中，纳豆激酶可以改善血液流变学，抑制血小板聚集，通过促进t-PA和UK基因表达而提高机体的纤溶活性[11].在小鼠的体内实验中，纳豆激酶通过抑制脂多糖(LPS)诱导的血清炎症因子水平，阻断了纤维蛋白在经内毒素治疗的动物的肾小球中的沉积[12].孟繁宇等[13]报道纳豆激酶具有抗炎、抗氧化的效果，并且具有软化、增加血管弹性，改善血脂及抗动脉硬化作用.

总的来说纳豆激酶的溶栓机理可以概括为4个方面：① 纤维蛋白直接溶解活性；② 通过促进尿激酶原生成尿激酶，激活体内纤溶酶原激活剂、抑制纤溶酶原激活物抑制剂，间接促进纤维蛋白溶解；③ 抗血小板凝集作用；④ 抗炎、抗氧化作用缓解血栓的形成.由此可见，纳豆激酶从多个路径层面发挥溶栓功效，相比于传统的溶栓药物，其具有更高的利用价值和更广阔的发展前景.

1.2 纳豆激酶的抗高血压功能

根据世界卫生组织报道，全球约有11.3亿人患有高血压，高血压会显著加剧罹患心脏、大脑、肾脏疾病以及其他疾病的风险.在纳豆激酶的功能性研究中，Fujita M等[14]发现纳豆激酶抗高血压的功效，进一步研究发现抑制肾素上升、控制血管紧张素转化酶的生理活性是纳豆激酶抗高血压的主要机理，同时纳豆激酶可以减缓血管紧张素Ⅱ浓度升高，有助于血压平衡.在纳豆激酶抗高血压的动物实验中，Lee B H等[15]在动物模型实验中发现枯草芽孢杆菌发酵的木豆的水提取物(100 mg/kg)可以改善收缩压(21 mmHg)和自发性高血压大鼠的直立血压(30 mmHg)；在自发性高血压大鼠的降压作用实验中，喂食高剂量纳豆激酶(2.6 mg/g饮食)的基本饮食组显示收缩压(SBP)、舒张压(DBP)和血浆纤维蛋白原水平显著降低[16].人体研究表明纳豆激酶能降低血压和平衡血压.Kim J Y等[17]报道，与对照组相比，摄入含2 000 FU的纳豆激酶胶囊，收缩压(SBP)和舒张压(DBP)分别减低5.55 mmHg和2.84 mmHg；Gitte J等[18]发现摄入纳豆激酶对于人体收缩压和舒张压的平衡具有促进效果，与Fujita M等[14]纳豆激酶对于人体血压平衡的重要作用结果一致.鉴于此，纳豆激酶可能在预防和治疗高血压疾病中起重要作用，有望作为膳食补充剂应用到高血压患者的日常饮食中.

1.3 纳豆激酶的抗癌功能

癌症问题，已经成为世界范围内的健康问题，研究发现纳豆激酶在抗癌方面展现出一定的功效.Yan Y等[19]研究发现纳豆激酶粗提物(NCE)有效提高HCC荷瘤小鼠的存活率，对患病小鼠的肝腹水有一定的治疗效果，显著降低患病小鼠的肿瘤细胞扩增速度.Huang M等[20]将聚谷氨酸树状聚合物通过含二硫键的交联剂与纳豆激酶结合，通过体内和体外实验，显示了联合治疗结肠癌和血栓类疾病的潜力.Kou Y等[21]通过体内药代动力学和组织分布分析表明，纳豆激酶-聚唾液酸复合物(NK-PSA)可增强模型药物-阿霉素脂质体(DOX-SAL)的抗肿瘤活性，二者结合可能是清除癌症先关血栓(CAT)，并提高纳米颗粒和免疫细胞到达肿瘤的能力.

1.4 纳豆激酶的其他功能

纳豆激酶对改善心脑血管疾病、抗高血压、抗癌等方面表现出较好的作用，随着研究的深入，纳豆激酶的生物活性作用范围也在逐渐扩大.阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease，AD)是由细胞线粒体中β-淀粉样肽的选择性沉积，影响神经元和关键酶功能对葡萄糖的摄取过程，全球约有1800万AD患者.2013年,就有学者发现口服纳豆激酶在调节某些表征AD的因素中具有有效作用[22].Prakash B等[23]发现聚乳酸-乙醇酸(PLGA)包裹的纳豆激酶与家族蛋白(ten-eleven translocation-1，TET-1)偶联的纳米颗粒能够下调淀粉样蛋白的聚集并表现出纤溶活性，可作为抗AD的有效治疗药物.也有研究人员发现，纳豆激酶相比传统药物-辛伐他汀，在预防及治疗动脉硬化中具有潜在的临床应用前景[24].纳豆激酶对降低血脂、调节肠胃、排毒养颜等方面展现潜力，因此，对纳豆激酶需进行更深入的研究，合理运用纳豆激酶的保健功效，开发其保健市场.但是目前纳豆激酶酶活性半衰期短，口服摄取时生物利用率低，而直接注射使用又容易引发出血，这些特性仍需改善.

2 纳豆激酶增产技术研究

2.1 纳豆激酶生产优化

纳豆激酶主要以野生型枯草芽孢杆菌或基因工程菌接种到固体原料或液态材料中发酵产生，使用豆类或者配比合适的营养液作为发酵基质可以高效的生产纳豆激酶.豆类原料用于大规模工业化生产纳豆激酶成本较高，将工业生产的副产物废料与纳豆激酶的生产结合，解决工业资源浪费，提高资源利用率，降低了纳豆激酶的生产门槛.豆渣和豆粕中富含蛋白质、膳食纤维、矿物质和维生素等[25]，适宜于纳豆激酶的生产.张红运等[26]和古亚楠[27]将发酵的营养基质由培养基改为豆渣和豆粕，并将传统固体发酵改良为液体发酵，降低原料成本，提高生产效率.Ju S等[28]通过正交试验确定了枯草芽孢杆菌亚种WTC016生产纳豆激酶的最佳发酵条件.芝士乳清是乳品发酵工业中营养丰富的工业废料，Sahoo A等[29]将其作为一种低成本的发酵培养基用于枯草芽孢杆菌的生长和纳豆激酶的生产.Lan G等[30]选择将纳豆发酵菌与乳酸菌和双歧杆菌混合发酵，与单菌株发酵相比，纳豆激酶产量得到提升.Amin K等[31]在纳豆激酶生产研究中发现，调节发酵液的亚硒酸钠浓度至5 mg/L，纳豆芽孢杆菌的发酵活力显著提高；大豆分离蛋白酶解物作为芽孢杆菌的补充氮源，对纳豆激酶的酶活力也具有促进作用[32].

2.2 纳豆激酶生产菌转基因改造

1992年，Nakamura T等[33]对纳豆激酶进行基因测序，为纳豆激酶活性利用和产酶能力的提高打下基础.纳豆激酶的生产菌株由天然菌株发展为转基因菌株，常用的有大肠杆菌、酿酒酵母、地衣芽孢杆菌、假单孢铜绿菌等.Mohammadi F等[34]和王开敏等[35]通过聚合酶链式反应(PCR)扩增基因片段，构建纳豆激酶重组质粒，诱导表达到大肠杆菌BL21(DE3)、酿酒酵母H158，获得了具有纤溶活性的纳豆激酶.Cai D等[36-38]通过诱导基因突变的方式，将地衣芽孢杆菌、铜绿假单胞菌作为基因工程菌株，显著提高纳豆激酶的生产效率.Liu Z等[39]构建了枯草芽孢杆菌WB800菌株6个具有单一启动子不同的质粒重组菌株(PP43、PHpaII、PBcaprE、PgsiB、PyxiE或PluxS)，设置随机串联质粒组别，最终PHpaII-PHpaII-PP43排列情况下纳豆激酶在启动子介导下的最高产率达到264.2±7.0 FU/mL，纳豆激酶产率显著提高.Cai Y等[40]通过DNA家族包装技术将3个同源基因改组以产生突变体文库，应用于纳豆芽孢杆菌，所产的纳豆激酶活性是野生型的2.3倍.对发酵菌种基因改造显著提高发酵过程中纳豆激酶的产率，推进了纳豆激酶的产业发展.

3 纳豆激酶的增效措施及其稳定性与安全性

3.1 纳豆激酶增效性研究

有人发现，从红辣椒中分离出的亚油酸促进了纳豆激酶介导的纤维蛋白原的降解[41]，因此，以纳豆激酶和不饱和脂肪酸油的组合摄入，可能是治疗心血管疾病的新途径.Ren L等[42]通过偶联剂的作用，将纳豆激酶固定于磁性纳米粒子其最佳溶栓活性比纯纳豆激酶提高9.03%.黄梦杰[43]将靶向分子精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)通过羧氨反应连接到树状大分子上，随后通过化学方法将多谷氨酸树状大分子颗粒结合到纳豆激酶的周围，获得了具有血栓靶向性和较高酶活性的纳豆激酶.

纳豆激酶的靶向性研究，减少了药物的必需摄入剂量，有望实现将药物效用最大化.Kou Y等[21]通过静电作用将聚唾液酸(PSA)与纳豆激酶形成复合物(NK-PSA)并用阿霉素脂质体用作模型药物，结果表明纳豆激酶聚合物可以提高纳米颗粒和免疫细胞的递送能力.邓柳艳和张建华[44]将微胶囊技术应用于纳豆激酶的靶向性研究，用叶酸靶向纳豆激酶，微胶囊处理后，在体外模拟胃环境实验纳豆激酶的活性保留率达60%；有研究者将纳豆激酶通过扩散加载到微胶囊中，其渐进的释放过程有较高的靶向活化血小板活性[45].Wu C等[46]将纳豆激酶与聚赖氨酸树脂状大分子(PLLD)通过纳米技术制备成一种小分子复合材料，有效控制了纳豆激酶释放功效的作用位点，为纳豆激酶的安全性提供新的研究方向.

3.2 纳豆激酶的稳定性

纳豆激酶较易受不良环境影响而丧失生物活性，酶的稳定性主要与其分子结构特征和表面活性基团有关，Liu Z等[47]通过表面电荷工程序列对比，并基于文献构建了11个突变体，并针对其独特的催化特性筛选了4个单点突变：Q59E增加了比活性、S78T提高了酸稳定性、Y217K增强了耐酸性和热稳定性、N218D改善了热稳定性，进而构建并表征了多点位突变体，获得了具有更好的酸稳定性和热稳定性的一种突变体菌株.蒙新睿[1]和赵菡[48]在纳豆激酶的热稳定性提高研究中，将相关点位的氨基酸进行筛选突变，其稳定性提高效果明显.

3.3 纳豆激酶的安全性

纳豆激酶作为一种注射制剂用于血栓疾病时，易被识别为免疫抗原，而引发出血.Vianney Y M等[49]通过预测纳豆激酶的B细胞表位，准确找到氨基酸残基中负责免疫原性的位点，进行包埋改造，在保持纳豆激酶生物活性的同时，提高其作为可注射治疗蛋白质的安全性.温度过高的情况下，纳豆激酶溶栓活性常被认为已经丧失，但是有文章报道经高温处理后，纳豆激酶激活t-PA酶原的活性功能仍然存在，而这种特性对常规血栓药物敏感患者有更温和的效果[50]，对于纳豆激酶的安全应用具有一定的指导作用.当纳豆激酶的使用量达到300 mg/kg时，会引发肺出血，纳豆激酶的标准安全边际(SSMs)为4.0，Guo H等[51]将地塞米松与纳豆激酶联合治疗血栓类疾病，其SSMs扩大至8.0.牛磺去氧胆酸盐(TUDCA)具有维持细胞稳态的作用，其机制与其调节细胞膜的磷脂和蛋白质功能有关，Feng R等[52]制备了一种新型纳豆激酶-牛磺去氧胆酸(NK-TUDCA)复合物，显著降低纳豆激酶的出血概率.因此，将具有缓释和稳态功能的大分子与纳豆激酶聚合，抑制纳豆激酶强烈溶栓效果，可以为纳豆激酶的温和释放溶栓功能创造条件.

4 结语

纳豆激酶抗血栓的功效研究已经非常明确，作为保健食品已经面向市场.但是其溶栓以外的生理功效研究还不够深入，机理尚不明确，应该继续加大研究力度，以拓展纳豆激酶的应用范围，这将极大的提升其发展前景.

纳豆激酶作为保健食品投放市场，其热稳定性差将极大地限制与其他食品的复配并严重影响其功效，因此正确的趋利避害，了解纳豆激酶的分子结构和化学性质，并且根据其特性，有针对性的设计纳豆激酶的改性产品，以提高其稳定性、安全性和利用率，是今后仍将努力的方向.