含附子-半夏温阳化痰汤对多囊卵巢综合征大鼠的毒性研究*

余 婷，苗 青，王瑞海，许 京，陈 怡，朱莉莉，许红英，张家玮，肖 苏，刘丽梅△

(1. 湖北省荆州市中医医院，湖北 荆州 434000；2. 中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700)

温阳化痰汤(药物组成：黑顺片、法半夏、陈皮、茯苓、甘草、苍术、白术、白芥子、淫羊藿、皂角刺、络石藤、巴戟、菟丝子、生山楂、神曲)是荆楚“刘氏妇科”奠基人、全国名老中医刘云鹏用于治疗多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)的临床经验处方。该方以反药组合“附子-半夏”为君药，用于临床10余年疗效显著，并无不良反应出现。然而附子与半夏同用属“十八反”配伍禁忌范畴，其能否同用历来颇有争议[1-2]，其用药安全性值得探讨。

研究发现，附子中主要的毒性成分为双酯型二萜类生物碱[3]，半夏中的主要毒性成分可能为特殊晶型的草酸钙针晶[4]。据报道，附子半夏配伍后，双酯型二萜类生物碱的含量明显增高，毒性增强[5]。实验表明，附子-半夏药对配伍用药后对大鼠心脏有明显的毒性反应，对肾脏和肝脏形态学也有影响[6]。因此，本研究在中医理论的指导下，基于PCOS大鼠模型，探讨温阳化痰汤对附子-半夏毒性靶器官(心、肝、肾)的毒性作用，以评价该方安全性，为临床安全用药提供依据。

1 材料

1.1 药品与试剂

黑顺片、法半夏、陈皮、茯苓、甘草、苍术、白术、白芥子、淫羊藿、皂角刺、络石藤、巴戟、菟丝子、生山楂、神曲均购自北京市双桥燕京中药饮片厂，批号分别为1609014、1609042、1609050、1610035、1609010、1607053、1607027、1512013、1608042、1610039、1603023、1608079、1608006、1609032、1606028，芙瑞来曲唑片购自浙江恒瑞医药股份有限公司，批号16113058。

1.2 仪器设备

AU480全自动生化仪(奥林巴斯株式会社，东京，日本)；Pannoramic 250 Pannoramic MIDI 病理切片扫描仪(3D HISTECH, Inc.，布达佩斯，匈牙利)；Neofuge 15R台式高速冷冻离心机(力康生物医疗科技控股有限公司，中国香港)。

1.3 动物

8周龄雌性SD大鼠，体质量(230±10)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2014-0013。本实验已通过中国中医科学院中医基础理论研究所实验动物伦理委员会审查。

2 方法

2.1 中药提取液的制备

温阳化痰汤的制备方法：黑顺片10 g加入8倍量水浸泡30 min，加热煎煮30 min后加入已浸泡30 min的其他药物，继续煎煮30 min，趁热过滤得滤液I；滤渣加入6倍量水煎煮30 min，趁热过滤得滤液II；合并2次滤液加热浓缩即得温阳化痰汤，其生药质量浓度为1.62 g·mL-1。

附子-半夏合煎液的制备方法：黑顺片10 g加入8倍量水浸泡30 min，加热煎煮30 min后加入已浸泡30 min的法半夏9 g，继续煎煮30 min，趁热过滤得滤液I；滤渣加入6倍量水煎煮30 min，趁热过滤得滤液II；合并2次滤液加热浓缩即得附子-半夏合煎液，其生药质量浓度为0.171 g·mL-1。

2.2 PCOS动物模型的建立

图1示，本实验选用来曲唑诱导法建立PCOS大鼠模型[7-8]。正常饲养SD雌性大鼠，每天早上进行阴道涂片观察细胞的周期变化(4～5 d)，完成连续2个正常动情周期的大鼠纳入实验，未完成完整动情周期的大鼠剔除。将参与实验的大鼠随机取出20只，其余大鼠建立PCOS模型：用溶于1%羧甲基纤维素中的来曲唑溶液按照每日1 mg·kg-1的剂量连续灌胃21 d，同时进行阴道涂片观察，显示动情周期无规律(即可见大量白细胞，偶见少量角化细胞，处于动情间期，提示无排卵，见图1A)的大鼠为PCOS大鼠，动情周期规律(即可见大部分为角化细胞，处于动情期，见图1B)的大鼠剔除。

注：A.大鼠处于动情间期；B.大鼠处于动情期图1 大鼠阴道涂片比较(瑞氏染色 ×400)

2.3 大鼠分组与给药

20只动情周期规律的正常大鼠按随机数字表法分为正常组和温阳化痰汤正常组各10只，分别连续4周灌胃生理盐水和温阳化痰汤水煎液；挑选30只造模成功的PCOS大鼠，按随机数字表法分为模型组、温阳化痰汤PCOS组和附子-半夏PCOS组3组各10只，分别连续4周灌胃生理盐水、温阳化痰汤水煎液和附子-半夏合煎液。

2.4 血液生化指标检测

末次给药后禁食12 h(不禁水)，分别对各组大鼠麻醉后取血，离心分离血清，用全自动生化仪分别检测各组大鼠血清中肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)的水平。

2.5 主要脏器病理检测

各组大鼠取血后，立即打开腹腔摘取心脏、肝脏和肾脏，以4%多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋、切片、HE染色，在光学显微镜下观察各组织形态学变化。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 血液生化指标结果

图2示，给药4周后检测各组大鼠血液生化指标。

注：与正常组比较：*P<0.05，**P<0.01；与PCOS组比较：△P<0.05；与温阳化痰汤比较：#P<0.05，##P<0.01图2 各组大鼠血液生化指标比较

(1)心肌损害指标CK-MB和LDH：与正常组比较，PCOS组和附子-半夏PCOS组大鼠血清中CK-MB和LDH含量均显著升高(P<0.05，P<0.01)；与PCOS组比较，温阳化痰汤PCOS组大鼠血清中CK-MB和LDH含量均降低，其中LDH降低显著(P<0.05)；与温阳化痰汤PCOS组比较，附子-半夏PCOS组大鼠血清中CK-MB和LDH含量均显著升高(P<0.01)。

(2)肝功能指标ALT和AST：与正常组比较，PCOS组和附子-半夏PCOS组大鼠血清中ALT和AST含量均显著升高(P<0.05，P<0.01)；与PCOS组比较，温阳化痰汤PCOS组大鼠血清中ALT和AST含量均显著降低(P<0.05)；与温阳化痰汤PCOS组比较，附子-半夏PCOS组大鼠血清中ALT和AST含量均显著升高(P<0.01)。

(3)肾功能指标BUN和CR：与正常组比较，PCOS组和附子-半夏PCOS组大鼠血清中BUN和CR含量均升高，其中附子-半夏PCOS组升高显著(P<0.05，P<0.01)；与PCOS组比较，温阳化痰汤PCOS组大鼠血清中BUN和CR含量均降低，但差异无统计学意义；与温阳化痰汤PCOS组比较，附子-半夏PCOS组大鼠血清中BUN和CR含量均升高，其中CR含量升高显著(P<0.05)。

3.2 各组大鼠心肌组织病理学变化

图3示，经HE染色后观察各组大鼠心肌组织形态学变化，正常组大鼠心肌细胞排列整齐，细胞核清晰且位于细胞中央；模型组大鼠心肌细胞排列紊乱，部分核仁消失，心肌纤维间隔增宽，可见部分肌纤维坏死，并伴有炎症细胞浸润；温阳化痰汤PCOS组大鼠心肌纤维间隔及心肌纤维排列尚可，与模型组比较心肌病理损伤程度明显减轻；附子-半夏PCOS组大鼠心肌细胞排列较为紊乱，部分发生弯曲呈波浪状，心肌纤维增粗，与温阳化痰汤PCOS组比较细胞间隙增大，横纹消失，大量炎性细胞浸润；温阳化痰汤正常组大鼠心肌细胞排列紊乱，与正常组比较心肌纤维增粗细胞间隙变宽、横纹模糊，伴有炎症细胞浸润。

3.3 各组大鼠肝脏组织病理学变化

图4示，经HE染色后，观察各组大鼠肝脏组织形态学变化，正常组大鼠肝细胞索呈放射状整齐排列，无明显炎性细胞浸润；模型组大鼠肝细胞索排列紊乱，可见明显的大泡性脂肪变性，汇管区胶原纤维显著增生并向小叶内延伸，有较多炎细胞浸润；温阳化痰汤PCOS组大鼠肝细胞索排列较整齐，与模型组比较肝细胞脂肪变性明显减轻，有散在的炎细胞浸润；附子-半夏PCOS组肝细胞索排列紊乱，可见明显的大泡性脂肪变性，中央静脉周围轻度水肿，并伴有炎性细胞浸润；温阳化痰汤正常组肝细胞排列紊乱，与正常组比较汇管区周围胶原增生，有大量炎性细胞浸润。

3.4 各组大鼠肾脏组织病理学变化

图5示，经HE染色后观察各组大鼠肾脏组织形态学变化，正常组大鼠肾小球无明显病理改变，结构完整，毛细血管开放；模型组大鼠肾小球基底膜明显增厚，系膜区增宽，肾小管上皮细胞界限不清，少量细胞坏死，并伴有炎性细胞浸润；温阳化痰汤PCOS组大鼠肾小球结构无明显异常，基底膜增厚程度显著改善；附子-半夏PCOS组大鼠肾小球基底膜明显增厚，系膜区增宽，系膜细胞高度增生，肾小管上皮细胞界限不清，胞浆疏松，少量细胞坏死；温阳化痰汤正常组大鼠肾小球基底膜稍增厚，肾小管上皮细胞肿胀，胞浆疏松、淡染。

注：A.正常组；B.PCOS组；C.温阳化痰汤PCOS组；D.附子-半夏PCOS组；E.温阳化痰汤正常组图3 各组大鼠心脏切片比较(HE染色，×200)

注：A.正常组；B.PCOS组；C.温阳化痰汤PCOS组；D.附子-半夏PCOS组；E.温阳化痰汤正常组图4 各组大鼠肝脏切片(HE染色，×200)

注：A.正常组；B.PCOS组；C.温阳化痰汤PCOS组；D.附子-半夏PCOS组；E.温阳化痰汤正常组图5 各组大鼠肾脏切片比较(HE染色，×200)

4 讨论

PCOS是妇科常见的内分泌疾病，以月经紊乱、不孕、多毛、肥胖、痤疮、雄激素过高、双侧卵巢持续增大及持续无排卵为临床特征，严重困扰着广大女性患者[9]。现代研究表明，中医药治疗PCOS较西药治疗疗效更显著，且毒副作用较小。PCOS属于中医学“不孕”“月经稀少”“月经后期”“闭经”“癥瘕”“崩漏”等范畴[10]。刘云鹏行医济世80余年，对妇科有丰富的临床经验，认为肾虚是PCOS的根本病机[11]。通过长期的临床观察发现，脾肾阳虚夹痰湿型的PCOS患者居多，然而运用常规的温补肾阳配伍化痰药物组方治疗临床疗效并不太理想。经过长期临床实践，师法仲景自创温阳化痰汤。该方以附子-半夏共为君药，辛开燥降，相辅相成，散脏腑经络、肌表上下的痰饮停滞，使阴寒得散、脾肾得温、水湿得化、痰饮得消，则阳虚痰浊诸症自除。该方虽含有反药组合附子-半夏，但疗效显著并无不良反应出现，提示二者同用“相反”不是绝对禁忌。

CK-MB、LDH、ALT、AST、BUN和CR是目前诊断心脏、肝脏、肾脏疾病较常用的指标，其在血液中的含量可客观反映各脏器细胞损伤的严重程度，对于临床诊断具有重要的参考意义[12-14]。在本实验中，由血液生化指标检测结果发现，PCOS大鼠各指标水平均高于正常大鼠，表明PCOS对大鼠的心、肝、肾造成损伤，特别是对心和肝的损伤较严重；与模型组比较，附子-半夏PCOS组大鼠各指标水平显著升高，表明附子-半夏反药组合会进一步损伤心、肝、肾；与模型组比较，温阳化痰汤PCOS组大鼠各指标水平降低，表明温阳化痰汤可通过降低血清酶水平起到保护PCOS大鼠脏器的作用，同时也说明附子-半夏反药组合经配伍后对PCOS大鼠脏器的损害程度减弱；与正常组比较，温阳化痰汤正常组大鼠各指标水平升高，表明其可造成正常大鼠的脏器损伤。

经过显微病理学观察分析发现，与温阳化痰汤PCOS组大鼠比较，附子-半夏PCOS组大鼠的心脏、肝脏和肾脏形态学均可见明显的变化；与PCOS大鼠比较，正常大鼠经温阳化痰汤干预后，其心脏和肝脏形态学发生明显改变，均可见不同程度的损伤，肾

脏形态学改变不明显。结果表明，附子-半夏反药组合可严重损伤PCOS大鼠的脏器组织，但在复方中经配伍后对脏器的损害程度明显减弱；温阳化痰汤对正常大鼠的脏器组织可造成明显损伤，特别是对心肌细胞和肝细胞，但可缓解PCOS大鼠各脏器组织的病理变化；组织病理学的结果与血液生化指标的检测结果基本一致。

综上所述，在病理条件下附子-半夏反药组合在温阳化痰汤中的毒性降低；温阳化痰汤对PCOS大鼠未见明显毒性，对正常大鼠的毒性明显高于PCOS大鼠。由此可见，附子-半夏反药组合在复方中经配伍后其毒性会降低，体现了中药配伍减毒的特点；同时，温阳化痰汤的毒性在生理和病理状态下的动物中表现出较大差异，体现了明代著名医家张景岳在注释《素问·六元正纪大论篇》中提到的“有病则病受之”[15]的观点。本实验结果提示，在特定的病理条件下，附子-半夏反药组合在一段时间内、一定剂量范围内可与其他中药组成方剂使用。