YAP1在食管癌中的表达及其对体外食管癌细胞培养化疗敏感性的影响

张友明，姚 杰

(安徽省池州市人民医院胸心外科，安徽池州 247100)

食管癌是我国高发的消化道肿瘤之一，每年食管癌死亡患者高达15万人[1]。本病好发于40岁以上人群，男性患者多于女性，其典型症状以进行性吞咽困难为主，晚期患者还可能出现胸背疼痛，以及气管、支气管、肝、脑等脏器转移情况[2]。Yes相关蛋白1(YAP1)是新近发现的抑癌路径Hippo的重要调控因子。临床研究显示，YAP1在胃癌、非小细胞癌等多种肿瘤细胞中存在过度表达情况，提示高度活化的YAP1可能与胃癌、非小细胞癌等肿瘤疾病发生、发展有关[3]。但YAP1在食管癌中的表达及意义，以及对体外细胞培养化疗敏感性的影响如何，临床研究较少。为此，本研究选取本院保存的89例食管癌患者标本进行了分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年1月至2019年2月本院89例食管癌患者为研究对象，其中男49例，女40例；<60岁患者41例，≥60岁患者48例；食道上段18例，食道中段43例，食道下段28例。纳入标准：(1)均经病理学检查确诊；(2)临床病历资料完整；(3)术前未行放化疗。排除标准：(1)合并有其他系统恶性肿瘤；(2)有免疫系统疾病。食管癌患者的癌组织标本89份纳入食管癌组，癌旁组织(距癌边缘>5 cm，病理结果确认无癌细胞)标本89份纳入癌旁组织组。

1.2免疫组织化学染色 两组标本进行石蜡切片，并行常规脱蜡至水，选用北京中杉金桥生物技术有限公司提供的PV-600免疫组织化学试剂盒进行免疫组织化学检测，所有操作根据说明书进行，将滴入YAP1抗体的标本4 ℃冷藏过夜后，选用DAB进行显色，而后选用苏木素复染，并于显微镜下观察最终结果。

1.3体外药敏试验 将食管癌标本研磨碾碎，并滴加培养液，收集细胞悬液后于4 500 r/min，5 cm半径条件下离心15 min，沉淀后加入培养液反复吹打，最终获取肿瘤单细胞悬液，选用小牛血清对标本进行培养，并制备成细胞浓度为5×104的细胞悬液，随后将其接种至96孔板内。设置羟基喜树碱(HCPT)组、顺铂(CDDP)组、丝裂霉素(MMC)组氟尿嘧啶(5-FU)组、阿霉素(ADM)组及5个对照组，将15 μL 0.5 ng/mL抗肿瘤药物滴入孔板内，于室温下，10% CO2的温箱内培养24 h，取出后滴入15 μL 噻唑蓝(MTT)检测试剂，15 μL不完全培养液，静置反应3 h，4 000 r/min离心后，每孔滴入15 μL二甲基亚砜(DMSO)，反应8 min，选用南京德铁实验设备有限公司生产的HBS-1096C自动酶标仪检测每孔578 nm波长时的吸光度值，试验共重复2次，肿瘤细胞存活率取均值作为最终结果。

1.4判断标准 (1)免疫组织化学染色结果判断：在高倍镜下随机观察10个视野，每个视野计数100个细胞，其中染色强度记分如下，无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞比例<11%为1分，11%～<51%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。染色强度与阳性细胞比例得分之积≥3分为阳性表达。(2)化疗敏感性：肿瘤细胞存活率≤50%为敏感，而>50%为不敏感。

1.5统计学处理 采用SPSS22.0统计软件进行数据处理及统计分析，计数资料以例数或百分率表示，采用配对χ2检验进行比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1食管癌组与癌旁组织组YAP1蛋白表达 食管癌组与癌旁组织组YAP1蛋白阳性表达率分别为69.66%(62/89)、16.85%(15/89)，食管癌组YAP1蛋白阳性表达率明显高于癌旁组织组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：A为癌旁组织；B为食管癌组织。图1 免疫组织化学染色图(×200)

2.2YAP1蛋白表达与临床病理特征关系 TNM分期Ⅲ期、中-低分化、有淋巴结转移患者YAP1蛋白阳性表达率明显高于TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、高分化、无淋巴结转移患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 YAP1蛋白表达与临床病理特征关系

2.3体外化疗敏感性比较 YAP1阳性表达患者HCPT、CDDP、MMC敏感率分别为56.45%、30.65%和45.16%，明显低于YAP1阴性表达患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 YAP1阳性表达与阴性表达患者体外化疗敏感性比较[n(%)]

3 讨 论

Hippo信号路径是近年发现的一组信号转导路径，其上游主要由调节分子Ex、Kibra等组成，核心分子则以Mst1/2、Mob1及Lats1/2等为主，效应分子则由YAP1/TAZ构成[4-5]。Hippo信号路径活化时，效应分子表达水平将被抑制，其与细胞核的结合能力也将损伤，并因此失去转录辅助因子功能，导致细胞周期蛋白D1、结缔组织生长因子等与增殖相关基因的表达能力被阻断，细胞增殖受限；同时还可抑制DIPA1等与凋亡相关基因的表达，并加速细胞凋亡[6-7]。而当Hippo信号路径失活时，效应分子YAP1/TAZ表达率将大幅增加，并进入细胞核诱导细胞增殖，同时抑制其凋亡，导致细胞恶性化[8]。未分化的干细胞内存在大量未磷酸化的YAP1，这些YAP1将介导Hippo信号路径，并对干细胞的自我更新及增殖过程进行调节，最终影响组织器官的生长发育[9]。YAP1活性还可受Catenin蛋白调控，而Catenin蛋白同样与肿瘤发生、发展密切相关，Catenin蛋白具有促细胞黏附，抑制细胞侵袭和转移等功能。大量研究表明，恶性肿瘤细胞内的Catenin蛋白表达明显降低[10-11]。有研究发现，敲除YAP1基因后，干细胞含有的高迁移率族盒蛋白2及Oct4基因表达水平将大幅下降，甚至消失，而YAP1过度表达将诱使多能干细胞编程效率提升2倍[12]。本研究中，食管癌YAP1蛋白阳性表达率为69.66%，明显高于癌旁组织，表明YAP1蛋白异常表达与食管癌密切相关。还有研究发现，食管癌及食管不典型增生患者病灶组织内可见YAP1同时表达于细胞质及细胞核内，该研究认为慢性炎性反应癌变过程中，YAP1的高表达可能参与炎症性疾病的恶性化，这也可能是YAP1参与恶性肿瘤发生的又一机制[13]。另外，有研究发现，宫颈鳞癌病灶组织内YAP1表达率明显上升，高于健康组织，并且其表达率与患者疾病分化程度、淋巴结转移及复发与否有关[14]。本研究中，TNM分期Ⅲ期、中-低分化、有淋巴结转移患者YAP1蛋白阳性表达率明显高于TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、高分化、无淋巴结转移患者，这与前述研究结果相似，提示YAP1与肿瘤疾病分期、分化程度、是否有淋巴结转移密切相关。

手术联合辅助化疗是多种恶性肿瘤的常用治疗方案，但多数肿瘤患者存在先天性或获得性放化疗耐药情况[15]。因此，有效地评估肿瘤患者药物敏感性对食管癌的治疗具有重要意义。本研究中，YAP1阳性表达患者对HCPT、CDDP和MMC的敏感率分别为56.45%、30.65%和45.16%，明显低于YAP1阴性表达患者，差异有统计学意义(P<0.05)，而YAP1阳性表达和阴性表达患者对5-FU和ADM的敏感率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。通过对以上结果分析，可以发现YAP1阳性表达可降低食管癌患者对HCPT、CDDP和MMC的药物敏感性，但对5-FU和ADM敏感性无明显影响，临床需酌情选用5-FU和ADM来治疗YAP1阳性表达的食管癌患者。

本研究结果发现，食管癌组织内的YAP1蛋白阳性表达率明显升高，并与TNM分期、分化程度及淋巴结转移关系密切，同时还对患者化疗药物敏感性存在一定影响，临床可通过检测YAP1来评估食管癌TNM分期、分化程度及是否有淋巴结转移，并提示患者对化疗药物的不同敏感性。但由于本组研究纳入样本量小，需要进一步扩大样本量进行研究。