呼吸道感染耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌分子流行病学及临床特征*

王 娟，谢良伊△，蔡 亮，欧阳鹏文，姜 斌，彭 娜，刘 念，李凤容

(1.湖南省人民医院/湖南师范大学附属第一医院检验科,湖南长沙 410005;2.湖南省疾病预防控制中心微生物检验科,湖南长沙 410005;3.湖南省人民医院/湖南师范大学附属第一医院呼吸内科,湖南长沙 410005;4.湖南省人民医院/湖南师范大学附属第一医院院感科,湖南长沙 410005)

近年来，随着产超广谱β内酰胺酶(ESBLs)肠杆菌科细菌的广泛传播，导致大量碳青霉烯类抗菌药物，包括亚胺培南、美罗培南、厄他培南等的使用，使得对该类药物耐药的肠杆菌科细菌，即耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(CRE)逐年增加。中国细菌耐药监测网(CHINET)的数据显示，肺炎克雷伯菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别从2005年的3.0%和2.9%上升到2017年的20.9%和24.0%，耐药率上升幅度较大，与此同时，肺炎克雷伯菌每年的分离率也呈上升趋势[1]。有研究报道CRE感染的肺炎患者病死率很高[2-4]。本研究分析了呼吸道感染CRE主要耐药机制及分子流行病学特征，并分析其在临床特征上的差异。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集湖南省人民医院/湖南师范大学附属第一医院2018年分离出的非重复呼吸道感染CRE菌株，所有菌株均经过VITEK2 Compact全自动微生物分析系统进行鉴定。菌株来源患者均有下列症状中的一项以上：发热；新发的咳嗽、咳痰或原有咳嗽、咳痰加重；肺实变体征或闻及湿啰音；外周血白细胞计数>10×109/L，伴或不伴有核左移；影像学有肺部阴影或间质性改变。所有痰液标本均为合格标本。

1.2仪器与试剂 血琼脂平板、Mueller-Hinton琼脂平板、VITEK2 Compact全自动微生物分析系统及其配套的鉴定药敏卡均购自法国生物梅里埃公司，PCR仪购自eppendorf公司，DYY-6K型电泳仪购自北京六一仪器厂，凝胶成像仪购自美国BIO-RAD公司，DNA Marker 2000购自宝生物工程(大连)有限公司，Trans PCR SuperMix反应液(内含所需ddH2O)及核酸染料购自北京全式金生物技术有限公司，引物由上海英潍捷基贸易有限公司合成。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853，均购自美国微生物菌种保藏中心。

1.3药敏试验 使用VITEK2 Compact全自动微生物分析系统进行药敏试验，依据美国临床和实验室标准协会(CLSI)相关标准判断药敏结果。

1.4细菌耐药表型试验 采用CLSI推荐的改良碳青霉烯灭活试验(mCIM)进行表型试验测定。

1.5细菌酶基因检测 PCR检测碳青霉烯酶基因，主要检测的基因种类包括Ambler A组酶基因中的blaKPC、blaNMC、blaIMI，Ambler B组酶基因中的blaNDM、blaIMP、blaVIM，以及Ambler D组酶基因中的blaOXA-48。

1.6多位点序列分型(MLST) 对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌及阴沟肠杆菌进行MLST，采用PCR技术分别扩增其7个管家基因。

1.7资料收集 收集所有菌株来源患者的年龄、性别等人口学资料，有无一年内住院史、入住ICU史，有无静脉置管、胸腔穿刺、气管插管，基础疾病，早期抗菌药物暴露史及住院、预后情况等。

1.8统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行数据处理及统计学分析，计数资料采用例数或百分率表示，采用Logistic回归分析和χ2检验对资料进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1菌株分布 共收集114株非重复呼吸道感染CRE，其中肺炎克雷伯菌108株，大肠埃希菌2株，阴沟肠杆菌4株。108株肺炎克雷伯菌有101株分离于痰液标本，7株分离于肺泡灌洗液。大肠埃希菌及阴沟肠杆菌均分离于痰液标本。

2.2药敏试验结果 肺炎克雷伯菌对头孢菌素类抗菌药物及酶抑制剂的耐药率超过80.0%，对阿米卡星的耐药率为32.41%，对替加环素的耐药率为10.19%。2株大肠埃希菌均对头孢菌素类抗菌药物及酶抑制剂耐药，对替加环素及阿米卡星敏感。4株阴沟肠杆菌对替加环素、阿米卡星、环丙沙星均敏感。见表1。

表1 114株CRE对常用抗菌药物的耐药性分析[n(%)]

续表1 114株CRE对常用抗菌药物的耐药性分析[n(%)]

2.3mCIM检测结果 114株CRE菌株，mCIM检测结果阳性的菌株有92株，所有mCIM检测结果阳性的菌株中85株检测出碳青霉烯酶基因，包括79株检测出blaKPC基因，5株检测出blaNDM基因和1株检测出blaIMP基因；所有mCIM结果阴性的菌株均未检测到试验所覆盖到的碳青霉烯酶基因，mCIM的灵敏度为100.0%。

2.4分子流行病学特征 114株CRE共有85株产碳青霉烯酶，占74.56%；108株肺炎克雷伯菌中产酶株有84株，占77.78%，其中 KPC-2占73.15%(79/108)，NDM-1占3.70%(4/108)，IMP-4占0.93%(1/108)；2株大肠埃希菌未检测出产酶株；4株阴沟肠杆菌中1株产NDM-1。108株肺炎克雷伯菌共分为6个ST型，以ST11型最多(77.0%)，其次为ST17，其他包括ST15、ST36、ST45、ST65；2株大肠埃希菌均为ST167型；4株阴沟肠杆菌为ST592。

2.5产酶株与非产酶株来源患者临床特征比较 114株CRE分为产酶株与非产酶株，来源患者临床特征见表2。χ2检验和Logistic回归分析结果显示，早期的碳青霉烯类抗菌药物使用者比例在产酶株与非产酶株中差异有统计学意义(P<0.05)，且其是产酶株的危险因素(OR:3.722，95%CI:1.529～9.057)。

表2 产酶株与非产酶株来源患者临床特征

3 讨 论

细菌耐药已成为全世界关注及棘手的难题，其中CRE在2017年已被WHO列为与耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌及铜绿假单胞菌并列的三大超级细菌。这些多重耐药菌极易在长期住院或者免疫力低下的患者中进行传播，导致院内感染，甚至可能造成小范围或者大面积的暴发流行。呼吸道感染CRE的患者在所有感染CRE患者中占比较高。有研究报道CRE感染的类型以肺炎感染为主，其次为尿路感染，且CRE感染肺炎致死率高达60%[4]。CRE感染在临床上是一件非常棘手的问题，目前临床疗效未见明显提高，有回顾性研究显示CRE的治疗常需要联合用药[5-8]，同时单药治疗的理论也有学者提出[4]。CRE治疗是联合用药还是单药治疗，联合哪些药物，如何联合，目前仍未明确。

有研究对CRE进行体外药敏性分析，发现其对几乎所有β-内酰胺类抗菌药物(包括广谱类头孢菌素类、头霉素类、β-内酰胺加酶抑制剂类及临床常用3种碳青霉烯类抗菌药物)、喹诺酮类抗菌药物呈现多重耐药[9-10]，与本研究结果相一致。CRE敏感性较高的药物为替加环素、阿米卡星等，这也验证了KULENGOWSKI等[11]的研究结果，即碳青霉烯类抗菌药物联合其他种类抗菌药物可以对CRE的治疗起一定作用。

在CLSI推荐的M100-S27文件中也已经将mCIM作为碳青霉烯酶表型筛选的参考方法之一，同时也有研究显示改良Hodge试验和Carba NP试验在检测产OXA-48酶和黏液型产NDM酶菌株时容易产生假阴性结果，而mCIM则为阳性结果，mCIM的灵敏度更高[12]。本试验采用mCIM进行碳青霉烯酶表型检测，发现所有检出酶基因型的菌株其mCIM结果都为阳性，所有表型阴性的菌株均未检出本试验包括的7种酶基因，证实了mCIM对碳青霉烯酶基因检出的灵敏度高。114株呼吸道CRE中85株碳青霉烯酶基因阳性，占74.56%，表明产酶是CRE的主要耐药机制。肺炎克雷伯菌主要以产碳青霉烯酶为主，对blaKPC基因进行亚型分型，主要为KPC-2型；大肠埃希菌未检测出酶基因型，4株阴沟肠杆菌中1株为NDM-1型。2017年中国学者ZHANG等[13]对全国1 105株不同类型标本分离的CRE进行分析，其主要产酶及酶亚型与本研究大致相同。英国一项研究报道CRE主要菌株类型为肺炎克雷伯菌，但酶基因主要为NDM[14]。一项北美的综合性回顾性研究表明KPC亚型主要为KPC-3，其次为KPC-2[15]。本研究对近年报道在肠杆菌科细菌中出现的blaOXA-48酶基因进行检测，未发现该基因型菌株，而该酶常在其他国家的肠杆菌科细菌中检出，尤其是欧洲国家[16]。MLST分析发现肺炎克雷伯菌主要流行株为ST11，占全部菌株的77.0%，这与ZHANG等[13]对我国肺炎克雷伯菌的分型一致，在美国及其他很多国家肺炎克雷伯菌的主要ST型为ST258[10，17]；大肠埃希菌的主要表型为ST167，而ZHANG等[13]发现大肠埃希菌主要ST型为ST131。

本研究临床资料分析显示，早期碳青霉烯类抗菌药物暴露史是CRE产酶株的一个危险因素，与新加坡一项关于成人住院患者CRE分子流行病学及临床特征的研究结果一致[18]。同时也有中国研究者报道菌株分离前第三、四代头孢菌素类和碳青霉烯类抗菌药物的使用是导致碳青霉烯类耐药的独立危险因素[19]。

目前，CRE耐药情况在抗菌药物广泛使用下日趋严重，本研究通过对呼吸道感染CRE流行病学及临床特征的分析发现，早期碳青霉烯类抗菌药物的使用是造成CRE产碳青霉烯酶的一个危险因素，提示临床工作者在抗菌药物的选择与使用上应谨慎，鉴定产酶株可为临床医务者在用药剂量及种类选择上给予一定的参考依据，同时CRE分子流行病学特征也为院内感染监测与控制提供了一定理论依据。

4 结 论

产碳青霉烯酶为CRE耐药的主要原因，早期的碳青霉烯类抗菌药物暴露是CRE产酶株的危险因素。